целом процедура SCNT удивительно сходна у многочисленных видов, клонированных к настоящему времени, что подчёркивает значимость этапов, показанных на рисунке 82.3.
Первый важный этап SCNT — получение соматических клеток от животного, которое предстоит клонировать (то есть донора соматических клеток). Крупный рогатый скот и другие виды взрослых животных клонировали с использованием различных типов диплоидных (2 n) клеток, включая, помимо прочих, фибробласты из разных источников, клетки гранулёзы антральных фолликулов, клетки кумулюса, а также клетки молочной железы, мышц, яйцевода, матки и других тканей. С практической точки зрения относительная простота получения фибробластов путём обычной биопсии кожи делает эти клетки предпочтительным выбором для клонирования взрослых самцов и самок. У коров клетки яичника и гранулёзы можно легко получить с помощью той же трансвагинальной аспирации под контролем ультразвука,
которая применяется для получения яйцеклеток (OPU). После получения соматические клетки можно использовать сразу или после длительного культивирования. Большинство типов соматических клеток легко разделить на отдельные клетки, получив суспензию с помощью раствора на основе трипсина. Интересно, что на результаты сильнее влияет клеточная линия, чем тип клеток. Если результаты оказываются хуже ожидаемых, исследователи могут взять у донора соматических клеток ещё один образец ткани, чтобы создать другую клеточную линию, прежде чем переходить к иному типу клеток. Теперь известно, что для клонирования взрослых животных не требуется вводить соматические клетки в состояние покоя путём выдерживания в среде без сыворотки перед переносом ядра.
Следующий важный этап SCNT — получение ооцитов от самок-доноров. Яичники животных с бойни служат обильным и недорогим источником ооцитов. Возможность получить клонированное потомство после созревания in vitro делает этот источник и подход предпочтительными для получения ооцитов на стадии MII. Когда важно контролировать генетическое происхождение и/или материнское происхождение донорских ооцитов, процедуры OPU позволяют получать небольшое число ооцитов от живых коров. Созревание in vitro хотя и уступает созреванию in vivo в граафовом фолликуле или фолликулах, позволяет точнее отбирать ооциты на стадии MII через 18–20 часов.
Следующий и, возможно, самый трудоёмкий этап SCNT — удаление материнской (ядерной) ДНК из ооцитов на стадии MII с помощью микроинструментов (см. рисунок 82.3). Добавление в среду, в которой находятся ооциты, ингибитора микрофиламентов (например, цитохалазина B) делает цитоплазму более податливой и позволяет механически удалить путём аспирации 5–15% цитоплазмы ооцита, содержащей материнскую (ядерную) ДНК. Это важно для снижения частоты лизиса, который в противном случае происходил бы без добавления ингибитора микрофиламентов. Добавление в среду красителя Хёхста позволяет убедиться, что ядерная ДНК успешно удалена. Если ограничить воздействие ультрафиолетового света только участком микроинструмента, содержащим материнскую ДНК, можно избежать повреждения оставшегося «мешочка» цитоплазмы ооцита: в нём уже нет ядерной ДНК, но сохраняются митохондриальная ДНК, необходимые органеллы и другие важнейшие компоненты, характерные для ооцита.
Следующая задача при проведении SCNT — перенести соматическое ядро из клетки животного, которое предстоит клонировать, в лишённый ядра «мешочек» цитоплазмы ооцита. У большинства видов, за исключением мышей, это достигается путём слияния соматической клетки с лишённым ядра «мешочком» цитоплазмы ооцита под действием электрического импульса. Для этого целую соматическую клетку с помощью микроинструментов механически помещают в перивителлиновое пространство (пространство
Таблица 82.1 Развитие клонированных эмбрионов овец, полученных с использованием трёх разных типов клеток
| Тип клеток | Число слившихся клеточных пар (%) | Число морул/ бластоцист (%) | Число беременностей/ число реципиентов (%) | Число живых ягнят |
|---|---|---|---|---|
| Эпителий молочной железы | 277 (63.8) | 29 (11.7) | 1/13 (7.7) | 1 (0.36%) |
| Фибробласты плода | 172 (84.7) | 47 (37.9) | 5/16 (31.3) | 3 (1.74%) |
| Клетки эмбрионального происхождения | 385 (82.8) | 126 (54.5) | 15/32 (46.9) | 4 (1.04%) |
Источник : адаптировано по: Wilmut I, Schnieke A, McWhir J, Kind A, Campbell K. Жизнеспособное потомство, полученное из клеток плода и взрослого млекопитающего. Nature 1997;385:810–813, с разрешения Nature Publishing Group.
между блестящей оболочкой и лишённым ядра «мешочком» цитоплазмы ооцита). Полученную «клеточную пару» (лишённый ядра «мешочек» цитоплазмы ооцита и соматическую клетку) помещают между двумя электродами и кратковременно воздействуют на неё импульсом электрического тока. У крупного рогатого скота воздействие 2.2 кВ/cm в течение 40 с
вызывает слияние более 70% клеточных пар. Воздействие электрического тока приводит к образованию пор в мембранах обеих клеток. Для переноса соматического ядра в «мешочек» цитоплазмы ооцита путём электрослияния необходим непрерывный контакт между
Доноры ооцитов
2) Получить ооциты от коров-доноров
• На бойне
• Получение яйцеклеток (OPU) путём трансвагинальной аспирации
3) Культивировать ооциты в течение от 18 до 20 ч
Цитоплазма
MII, полярное тельце 4) Удалить ядра из зрелых ооцитов
с помощью микроинструментов
(то есть удалить ядерную ДНК)
1) Получить и культивировать 5) Поместить соматическую клетку
соматические клетки рядом с цитоплазмой ооцита
Донор соматических клеток
(Животное, которое предстоит клонировать) +
6) Подать электрический импульс или импульсы, чтобы
вызвать слияние соматической клетки и цитоплазмы ооцита
– (то есть электрослияние)
7) Эмбрион, созданный из цитоплазмы ооцита
(от донора ооцита) и клетки
донора соматических клеток
Клонированный
8) Активация (имитирует действие сперматозоида)
например, g клетки яичника/гранулёзы. Эмбрион
Фибробласты кожи
9) Культивирование клонированных эмбрионов в течение 7
— 8 дней
Монослой соматических клеток. 10) Перенос клонированных эмбрионов
суррогатным реципиентам
Разделение соматических клеток с получением
суспензии отдельных клеток с помощью
Амниотическая
трипсина
жидкость
11) Диагностика беременности с помощью
ультразвукового исследования
Клонированный
эмбрион Амноин
12) Клонированное потомство донора соматических
клеток (рождение в срок
~280 дней)
Рисунок 82.3 Различные этапы переноса ядер соматических клеток (SCNT), применяемые для клонирования взрослых животных. Хотя на схеме показано клонирование коровы, процедуры SCNT в целом сходны у разных видов. (1) На первом этапе у животного, которое предстоит клонировать, получают соматические клетки (донор соматических клеток). (2) Ооциты получают от коров на бойне или путём трансвагинальной аспирации (ovum pick-up, OPU). (3) Ооциты могут дозревать in vitro . (4) Затем из ооцита с помощью микроинструментов удаляют ДНК. (5) После этого соматическую клетку помещают рядом с оболочкой, содержащей цитоплазму ооцита. (6) Под действием электрического тока цитоплазма ооцита и соматическая клетка в большинстве случаев сливаются, (7) в результате чего фактически создаётся эквивалент 1-клеточного клонированного эмбриона. (8) В большинстве случаев электрического импульса, вызывающего слияние цитоплазмы ооцита с соматической клеткой, достаточно и для активации клонированного эмбриона, чтобы он начал развиваться. (9) Клонированные эмбрионы можно культивировать в лаборатории в течение определённого времени. (10) Затем для дальнейшего развития эмбрионы необходимо перенести суррогатным реципиентам. (11) Ультразвуковое исследование позволяет выявлять и контролировать наступившую беременность. (12) Лишь немногие клонированные эмбрионы развиваются до срока родов, в результате чего рождается живое потомство.
