между блестящей оболочкой и лишённым ядра «мешочком» цитоплазмы ооцита). Полученную «клеточную пару» (лишённый ядра «мешочек» цитоплазмы ооцита и соматическую клетку) помещают между двумя электродами и кратковременно воздействуют на неё импульсом электрического тока. У крупного рогатого скота воздействие 2.2 кВ/cm в течение 40 с
вызывает слияние более 70% клеточных пар. Воздействие электрического тока приводит к образованию пор в мембранах обеих клеток. Для переноса соматического ядра в «мешочек» цитоплазмы ооцита путём электрослияния необходим непрерывный контакт между
Доноры ооцитов
2) Получить ооциты от коров-доноров
• На бойне
• Получение яйцеклеток (OPU) путём трансвагинальной аспирации
3) Культивировать ооциты в течение от 18 до 20 ч
Цитоплазма
MII, полярное тельце 4) Удалить ядра из зрелых ооцитов
с помощью микроинструментов
(то есть удалить ядерную ДНК)
1) Получить и культивировать 5) Поместить соматическую клетку
соматические клетки рядом с цитоплазмой ооцита
Донор соматических клеток
(Животное, которое предстоит клонировать) +
6) Подать электрический импульс или импульсы, чтобы
вызвать слияние соматической клетки и цитоплазмы ооцита
– (то есть электрослияние)
7) Эмбрион, созданный из цитоплазмы ооцита
(от донора ооцита) и клетки
донора соматических клеток
Клонированный
8) Активация (имитирует действие сперматозоида)
например, g клетки яичника/гранулёзы. Эмбрион
Фибробласты кожи
9) Культивирование клонированных эмбрионов в течение 7
— 8 дней
Монослой соматических клеток. 10) Перенос клонированных эмбрионов
суррогатным реципиентам
Разделение соматических клеток с получением
суспензии отдельных клеток с помощью
Амниотическая
трипсина
жидкость
11) Диагностика беременности с помощью
ультразвукового исследования
Клонированный
эмбрион Амноин
12) Клонированное потомство донора соматических
клеток (рождение в срок
~280 дней)
Рисунок 82.3 Различные этапы переноса ядер соматических клеток (SCNT), применяемые для клонирования взрослых животных. Хотя на схеме показано клонирование коровы, процедуры SCNT в целом сходны у разных видов. (1) На первом этапе у животного, которое предстоит клонировать, получают соматические клетки (донор соматических клеток). (2) Ооциты получают от коров на бойне или путём трансвагинальной аспирации (ovum pick-up, OPU). (3) Ооциты могут дозревать in vitro . (4) Затем из ооцита с помощью микроинструментов удаляют ДНК. (5) После этого соматическую клетку помещают рядом с оболочкой, содержащей цитоплазму ооцита. (6) Под действием электрического тока цитоплазма ооцита и соматическая клетка в большинстве случаев сливаются, (7) в результате чего фактически создаётся эквивалент 1-клеточного клонированного эмбриона. (8) В большинстве случаев электрического импульса, вызывающего слияние цитоплазмы ооцита с соматической клеткой, достаточно и для активации клонированного эмбриона, чтобы он начал развиваться. (9) Клонированные эмбрионы можно культивировать в лаборатории в течение определённого времени. (10) Затем для дальнейшего развития эмбрионы необходимо перенести суррогатным реципиентам. (11) Ультразвуковое исследование позволяет выявлять и контролировать наступившую беременность. (12) Лишь немногие клонированные эмбрионы развиваются до срока родов, в результате чего рождается живое потомство.
Таблица 82.2 Потенциал развития клонов коров, полученных методом SCNT (с использованием клеток яичника/гранулёзы и фибробластов кожи), или эмбрионов, in vitro полученных путём in vitro оплодотворения
| Эмбрионы | Число | Число начавших дробление (%) | Число морул и эмбрионов на 6-е сутки и 7-е сутки на стадии бластоцисты эмбрионы (%) |
|---|---|---|---|
| Клоны | 686 | НД | 207 (30.2) |
| Полученные in vitro | 863 | 705 (81.7) | 235 (27.2) |
НД — не определено. Источник : адаптировано по Edwards J, Schrick F, McCracken M и др. Клонирование взрослых сельскохозяйственных животных: обзор возможностей и проблем, связанных с переносом ядер соматических клеток. Am J Reprod Immunol 2003;50:113–123.
соматической клеткой и цитоплазмой ооцита. Слияние может произойти в зависимости от степени взаимодействия их мембран. Через несколько минут после введения соматического ядра в оболочку, содержащую цитоплазму ооцита, ядерная оболочка разрушается, а хроматин конденсируется. Успешное выполнение этой процедуры фактически позволяет создать эквивалент 1-клеточного эмбриона.
В некоторых случаях электрического импульса, используемого для слияния, достаточно также для «активации» клонированного эмбриона и начала его развития; в других случаях применяют различные сочетания химических веществ. Независимо от выбранного способа «запуска» развития эмбриона главная задача протоколов активации — воспроизвести процессы, важные для развития и происходящие после оплодотворения. Слово «воспроизвести» употреблено намеренно, поскольку сперматозоид не требуется для такого типа бесполого размножения. После активации клонированные эмбрионы, в зависимости от вида животного, могут быть перенесены в перевязанные яйцеводы (что предотвращает их попадание в матку временных реципиентов; именно так поступили при клонировании Долли), в матку (у свиней) либо помещены в инкубатор на время, необходимое для развития до стадии компактной морулы или бластоцисты (у крупного рогатого скота). Клонированные эмбрионы крупного рогатого скота достигают стадии бластоцисты с той же частотой, что и эмбрионы, полученные путём in vitro оплодотворения (таблица 82.2).
Для переноса эмбрионов суррогатным реципиентам применяют тот же подход, что и при переносе эмбрионов, полученных in vitro или in vivo, однако при этом возникают некоторые дополнительные сложности. Клонированные эмбрионы могут повреждаться при переносе в матку суррогатных реципиентов, причём риск зависит от сложности процедуры. У крупного рогатого скота следует стремиться переносить эмбрионы до начала расширения бластоцеля или на его ранних стадиях; в противном случае расширяющийся бластоцель будет выпячиваться через отверстия в блестящей оболочке, образовавшиеся при предшествующем использовании микроинструментов (рисунок 82.4). Значительные выпячивания, напоминающие «цифру 8», могут объяснять, почему после переноса отдельных клонированных эмбрионов иногда отмечают рождение двойни. Частота наступления беременности после переноса одного или двух эмбрионов не различается. Перенос одного эмбриона помогает свести к минимуму осложнения, связанные с многоплодной беременностью. Тем не менее для предотвращения возможных проблем с аномальным выходом клонированных эмбрионов из оболочки можно переносить эмбрионы на более ранних стадиях развития (то есть на стадии компактной морулы или ранней бластоцисты). При этом необходимо особенно тщательно следить за соответствием стадии развития эмбрионов состоянию матки (то есть компактные морулы следует переносить реципиентам на -6-е сутки, а не на 7-и или 8-е). В зависимости от клеточной линии можно ожидать, что частота беременности на -28-е сутки составит
a
b
Рисунок 82.4 Клонированные бластоцисты крупного рогатого скота: (а) до расширения и (б) расширяющаяся бластоциста, у которой значительная часть полости бластоцисты выступает через отверстие в блестящей оболочке (наконечник стрелки), придавая ей вид «цифры 8».
у коров приближался к 50% после переноса одиночных эмбрионов, о чём свидетельствовало наличие собственно эмбриона с сердцебиением (таблица 82.3). Лишь небольшая часть клонированных эмбрионов, для которых подтверждена беременность, продолжает развиваться до срока родов и приводит к рождению живого потомства.
Применение SCNT
Успешное клонирование овец, крупного рогатого скота, свиней и коз подтверждает полезность SCNT для увеличения числа животных из клональных линий сельскохозяйственно важных продуктивных видов. Для генетического улучшения при сохранении максимального генетического разнообразия производителям необходимо также скрещивать свои лучшие клональные линии, создавая новые сочетания генов. Клоны, полученные методом SCNT, представляют собой лишь генетические копии существующих особей, что подтверждает безопасность употребления получаемых от них пищевых продуктов.9 Кроме того, возможности этой технологии для восстановления исчезающих и даже вымерших видов уже были продемонстрированы: первые успешные попытки были направлены на сохранение последней выжившей коровы породы с острова Эндерби10 и клонирование представителя исчезающего вида.11 Хотя SCNT применяли для клонирования домашних питомцев, очевидные фенотипические различия между генетически идентичными близнецами (наиболее близким к клонам природным аналогом) должны напоминать о том, что клонирование само по себе не позволяет после смерти животного или человека вернуть его к жизни.
Поскольку соматические клетки можно легко получать, размножать в виде клональных линий и генетически модифицировать в лаборатории до переноса ядра, SCNT является предпочтительным методом получения трансгенных сельскохозяйственных животных.12 Генетическая модификация соматических клеток до переноса ядра позволяет повысить эффективность получения трансгенных
