(a) (b)
(c) (d)
Рисунок 82.7Каждую исследованную плаценту после SCNT можно было отнести к одной из групп: гипоплазированная (a, 40-й день), частично развитая, с уменьшенным числом рудиментарных котиледонов (b, 45-й день), или практически нормальная (c, 50-й день). Для сравнения показана контрольная плацента (d, плацента плода, полученного методом IVMFC, на 53-й день). Воспроизведено по работе Hill J, Burghardt R, Jones Kи др.Доказательства того, что аномалии плаценты являются основной причиной гибели клонированных методом переноса ядер соматических клеток плодов крупного рогатого скота в первом триместре.Biol Reprod2000;63:1787–1794, с разрешения Wiley-Blackwell. Изображение любезно предоставлено доктором Джонатаном Хиллом из Квинслендского университета.
от коров, гомозиготных по MHC19(см. таблицу 82.3). Напротив, клеточные линии, при использовании которых наблюдалась высокая частота гибели плодов, были получены от коров, гетерозиготных по MHC, что указывает на определённую степень несовместимости.
Во втором триместре беременности клонированным плодом частота самопроизвольных абортов возрастает. При полном макроскопическом и гистопатологическом исследовании абортированных плодов выявляется мало аномалий. Однако плаценты нередко имеют выраженные патологические изменения: число плодных котиледонов значительно снижено (иногда их менее 20 вместо ожидаемых 70–120)9(рисунок 82.8). Плодные оболочки обычно утолщены и отёчны.
Потери беременности в третьем триместре, особенно между 200 и 265 днями (нормальный срок родов — 280 дней), представляют собой более сложную проблему. Многие случаи гибели плодов в этот период связаны с повышенной частотой водянки аллантоиса (то есть водянки плодных оболочек) — чрезмерного накопления жидкости в различных отделах плаценты (например, g водянки аллантоиса или амниона)20и у плода (водянка плода). При умеренной или тяжёлой водянке живот заметно увеличивается из-за чрезмерного накопления жидкости (рисунок 82.9). В быстро развивающихся случаях возникает риск разрыва матки и других опасных осложнений у суррогатной коровы-реципиента, что требует немедленной эвтаназии.20Попытки «спасти»
(a) (b)
(c) (d)
(e)
203 дней
Рисунок 82.9(a) Суррогатная корова-реципиент с водянкой на 203-й день беременности. (b) После эвтаназии; яичник расположен на конце первого рога матки (на него указывает рука человека). (c) Более чёткое изображение матки с водянкой; плод находится в расположенном позади первом роге матки. (d) Аномальная плацента клонированного плода с плацентомами разного размера (от 50 g до 1 kg) и отёчными плодовыми оболочками. (e) Клонированный плод джерсейской породы массой 30 kg с увеличенной пуповиной. Изображение (d) воспроизведено по работе Edwards J, Schrick F, McCracken Mи др.Клонирование взрослых сельскохозяйственных животных: обзор возможностей и проблем, связанных с переносом ядер соматических клеток.Am J Reprod Immunol2003;50:113–123, с разрешения John Wiley & Sons.
плод путём экстренного кесарева сечения часто оказываются тщетными, поскольку плод к этому времени нередко уже мёртв. Даже если извлечь его достаточно рано, неонатальной помощи недостаточно, чтобы сохранить жизнь новорождённым, появившимся на свет на том сроке, когда диагностируется большинство случаев водянки. Для плацент клонированных плодов характерны значительно уменьшенное число плацентом разного размера и выраженная гипертрофия многих котиледонов. Нередко наблюдаются повышенная частота образования добавочных плацентом и сильный отёк межкотиледонарных участков плодных оболочек (см. рисунок 82.9).
Водянка плода часто наблюдается у клонов, развивавшихся при беременности, осложнённой водянкой. Большинство аномалий чрезмерно крупных клонированных плодов соответствуют последствиям водянки и плацентарной недостаточности. Обычно наблюдаются анасарка плода с генерализованным отёком и выраженный отёк пуповины (см. рисунок 82.9). В лёгких плодов на поздних сроках беременности обычно обнаруживаются чешуйки амниотического эпителия и меконий, что указывает на некоторую степень стрессавнутриутробноперед гибелью.
Хотя частота и тяжесть водянки при беременности клонированным плодом различаются, наблюдалась частота до 86%.9По нашему опыту, в 37% случаев из 58% всех беременностей, осложнившихся водянкой, её тяжесть требовала эвтаназии суррогатной коровы-реципиента во избежание дальнейшего вреда от осложнений. Некоторые производители, опрошенные FDA в рамках оценки рисков клонирования животных, начиная с 150-го дня беременности тщательно наблюдали за суррогатными коровами-реципиентами с помощью ультразвукового исследования на предмет появления признаков водянки. Учитывая неблагоприятный прогноз для плода и риск опасных осложнений у суррогатной коровы-реципиента, после постановки диагноза беременность следует прервать.
Хотя клоны могут погибнуть сразу после рождения или вскоре после него (в течение примерно 48 часов), выживаемость может достигать 50–70%. Выживаемость в некоторой степени связана с массой тела при рождении (рисунок 82.10). В выборке, представленной на рисунке 82.10, большинство выживших клонированных телят джерсейской породы (L, живые)
25
20 L L L L L L
15
D
10
D
5 D
E
D D
0 D
59 63 65 67 70 77 85 87 89 90 95 100
Масса тела при рождении (фунты)
N N N N N N N H H N N H
Плацента
Выживаемость (месяцы)
Рисунок 82.10Схематическое изображение продолжительности жизни (в месяцах) клонов джерсейских коров, полученных методом SCNT (L — живые; D — погибшие; E — подвергнутые эвтаназии), с учётом массы тела при рождении (в фунтах) и состояния плаценты (H — отёчная; N — без явных признаков отёка).
при рождении весили около 39 kg или меньше. Клоны джерсейских коров массой 40–45 kg погибали при рождении или спустя некоторое время после него. Из немногих клонированных эмбрионов, развивающихся до конца беременности, обычно рождаются более крупные телята; у некоторых наблюдаются клинические признаки синдрома крупного потомства, известного как синдром «теленка-пустышки». Частота случаев синдрома крупного потомства у клонированных телят, приводимая в публикациях, существенно различается — от 8 до 100%.9По нашему опыту и опыту других исследователей,9крупные телята не сразу встают на ноги, испытывают трудности с регуляцией температуры тела, имеют слабый сосательный рефлекс; пупочная область у них часто увеличена и отёчна, а мочевой проток остаётся открытым. У некоторых наблюдаются деформации конечностей, связанные с контрактурой сухожилий, непропорциональное или незрелое развитие органов, а также, возможно, повышенная восприимчивость к инфекциям. За телятами с клиническими признаками синдрома крупного потомства ведут интенсивное наблюдение; им могут назначать лечение многочисленных осложнений, включая, помимо прочего, незрелость лёгких, лёгочную гипертензию, дыхательные расстройства, гипоксию, гипотермию, гипогликемию, метаболический ацидоз, расширение пупочных вен и артерий и/или развитие сепсиса в структурах пуповины либо лёгких. В тяжёлых случаях целесообразна эвтаназия, поскольку, несмотря на чрезвычайные усилия по оказанию помощи, клоны чаще всего погибают.
Осложнения у клонированных телят могут оставаться незаметными в течение нескольких месяцев, при этом большинство случаев гибели приходится на возраст до 6 месяцев.9После этого выжившие клоны могут выглядеть «нормальными» и «здоровыми», пока неожиданно не проявится какая-либо патология. По нашему опыту, три клона погибли в возрасте 7.5, 8 и 9 месяцев, а ещё два — в возрасте 1 и 2.5 лет. Хотя отмечались разные патологии, несколько клонов погибли или были подвергнуты эвтаназии после повторявшихся эпизодов диареи, не поддававшейся лечению. Немногочисленные, но документально подтверждённые случаи внезапной гибели клонов при отсутствии каких-либо заболеваний у неклонированных животных, содержавшихся в тех же условиях, заставляют задуматься: была ли гибель связана с тем, что животное являлось клоном, или оно просто стало жертвой обстоятельств.
К счастью, большинство выглядящих здоровыми клонов, полученных в результате нормально протекавшей беременности, растут и развиваются нормально. К настоящему времени многочисленных клонов использовали для разведения, и они принесли потомство. Долли родила шесть ягнят: первой в 1998 году родилась Бонни, на следующий год — двойня, а ещё через год — тройня (рисунок 82.11). Спустя несколько лет Долли заразилась смертельным инфекционным заболеванием — лёгочным аденоматозом овец, вероятно, при контакте с другими животными стада. Многочисленные всесторонние исследования различных показателей у разных видов подтверждают нормальное состояние полученного потомства.
Независимо от вида, даже чрезвычайные усилия по созданию клонированных эмбрионов из соматической клетки и цитоплазмы ооцита с удалённым ядром позволяют получить лишь немногочисленное потомство. Как и у крупного рогатого скота, значительная часть потерь связана с гибелью эмбрионов и плодов на ранних стадиях. К счастью, у большинства других видов, клонированных к настоящему времени, в том числе у коз, осложнения, связанные с водянкой и синдромом крупного потомства, не представляют проблемы. После переноса в матку суррогатных самок более 100 1-клеточных клонированных эмбрионов размер помёта может составлять от нуля до восьми поросят.9Хотя отмечены отдельные аномалии, большинство клонов при рождении мельче, а не крупнее поросят, полученных при естественном спаривании или с применением методов IVMFC.9Более позднее применение SCNT для клонирования лошадей и домашних животных, таких как собаки, в большей степени объясняется недостатком сведений об оптимальных условиях созревания ооцитовin vitroи обеспечения развития эмбрионов на ранних стадиях при культивировании. Когда такие сведения стали доступны, удалось успешно клонировать лошадей методом SCNT и получить многочисленных клонов с использованием
