Воспроизводство крупного рогатого скота

25
20 L L L L L L
15
D
10
D
5 D
E
D D
0 D
59 63 65 67 70 77 85 87 89 90 95 100
Масса тела при рождении (фунты)
N N N N N N N H H N N H
Плацента
Выживаемость (месяцы)

Рисунок 82.10Схематическое изображение продолжительности жизни (в месяцах) клонов джерсейских коров, полученных методом SCNT (L — живые; D — погибшие; E — подвергнутые эвтаназии), с учётом массы тела при рождении (в фунтах) и состояния плаценты (H — отёчная; N — без явных признаков отёка).

при рождении весили около 39 kg или меньше. Клоны джерсейских коров массой 40–45 kg погибали при рождении или спустя некоторое время после него. Из немногих клонированных эмбрионов, развивающихся до конца беременности, обычно рождаются более крупные телята; у некоторых наблюдаются клинические признаки синдрома крупного потомства, известного как синдром «теленка-пустышки». Частота случаев синдрома крупного потомства у клонированных телят, приводимая в публикациях, существенно различается — от 8 до 100%.⁹По нашему опыту и опыту других исследователей,⁹крупные телята не сразу встают на ноги, испытывают трудности с регуляцией температуры тела, имеют слабый сосательный рефлекс; пупочная область у них часто увеличена и отёчна, а мочевой проток остаётся открытым. У некоторых наблюдаются деформации конечностей, связанные с контрактурой сухожилий, непропорциональное или незрелое развитие органов, а также, возможно, повышенная восприимчивость к инфекциям. За телятами с клиническими признаками синдрома крупного потомства ведут интенсивное наблюдение; им могут назначать лечение многочисленных осложнений, включая, помимо прочего, незрелость лёгких, лёгочную гипертензию, дыхательные расстройства, гипоксию, гипотермию, гипогликемию, метаболический ацидоз, расширение пупочных вен и артерий и/или развитие сепсиса в структурах пуповины либо лёгких. В тяжёлых случаях целесообразна эвтаназия, поскольку, несмотря на чрезвычайные усилия по оказанию помощи, клоны чаще всего погибают.

Осложнения у клонированных телят могут оставаться незаметными в течение нескольких месяцев, при этом большинство случаев гибели приходится на возраст до 6 месяцев.⁹После этого выжившие клоны могут выглядеть «нормальными» и «здоровыми», пока неожиданно не проявится какая-либо патология. По нашему опыту, три клона погибли в возрасте 7.5, 8 и 9 месяцев, а ещё два — в возрасте 1 и 2.5 лет. Хотя отмечались разные патологии, несколько клонов погибли или были подвергнуты эвтаназии после повторявшихся эпизодов диареи, не поддававшейся лечению. Немногочисленные, но документально подтверждённые случаи внезапной гибели клонов при отсутствии каких-либо заболеваний у неклонированных животных, содержавшихся в тех же условиях, заставляют задуматься: была ли гибель связана с тем, что животное являлось клоном, или оно просто стало жертвой обстоятельств.

К счастью, большинство выглядящих здоровыми клонов, полученных в результате нормально протекавшей беременности, растут и развиваются нормально. К настоящему времени многочисленных клонов использовали для разведения, и они принесли потомство. Долли родила шесть ягнят: первой в 1998 году родилась Бонни, на следующий год — двойня, а ещё через год — тройня (рисунок 82.11). Спустя несколько лет Долли заразилась смертельным инфекционным заболеванием — лёгочным аденоматозом овец, вероятно, при контакте с другими животными стада. Многочисленные всесторонние исследования различных показателей у разных видов подтверждают нормальное состояние полученного потомства.

Независимо от вида, даже чрезвычайные усилия по созданию клонированных эмбрионов из соматической клетки и цитоплазмы ооцита с удалённым ядром позволяют получить лишь немногочисленное потомство. Как и у крупного рогатого скота, значительная часть потерь связана с гибелью эмбрионов и плодов на ранних стадиях. К счастью, у большинства других видов, клонированных к настоящему времени, в том числе у коз, осложнения, связанные с водянкой и синдромом крупного потомства, не представляют проблемы. После переноса в матку суррогатных самок более 100 1-клеточных клонированных эмбрионов размер помёта может составлять от нуля до восьми поросят.⁹Хотя отмечены отдельные аномалии, большинство клонов при рождении мельче, а не крупнее поросят, полученных при естественном спаривании или с применением методов IVMFC.⁹Более позднее применение SCNT для клонирования лошадей и домашних животных, таких как собаки, в большей степени объясняется недостатком сведений об оптимальных условиях созревания ооцитовin vitroи обеспечения развития эмбрионов на ранних стадиях при культивировании. Когда такие сведения стали доступны, удалось успешно клонировать лошадей методом SCNT и получить многочисленных клонов с использованием

(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
(g) (h)
(i) (j)

Рисунок 82.12Схематическое изображение процедуры SCNT и развития эмбрионовin vitroпри клонировании собак. Первое полярное тельце (a, стрелка) и ядро ооцита (b, стрелка) удаляют из ооцитов, созревшихin vivoс помощью аспирационной пипетки. Удаление ядра можно подтвердить окрашиванием ядерного материала (b, стрелка). Соматические клетки втягивают в микропипетку (c) и помещают в перивителлиновое пространство ооцита с удалённым ядром (d). Слившиеся пары клеток активируют и культивируют в течение 7 дней. Клонированные эмбрионы на стадиях дробления: 2-клеточный (e), 4-клеточный (f), 8-клеточный (g), 16-клеточный (h), 32-клеточный или морула (i, j). Воспроизведено по публикации Jang G, Oh H, Kim Mи соавт.«Совершенствование процедуры переноса ядра соматической клетки у собак».Theriogenology2008;69:146–154 с разрешения Elsevier.

взрослых соматических клеток лошадей. Хотя частота потерь эмбрионов и плодов сопоставима с наблюдаемой у крупного рогатого скота (потери могут достигать 75–100% в зависимости от клеточной линии), в доступной литературе не описаны случаи осложнений беременности и нарушений у потомства, связанных с водянкой и синдромом крупного потомства.^21,22В большинстве случаев плаценты к концу беременности выглядят «нормальными», хотя у некоторых жеребят пуповина увеличена и отёчна.

Хотя процедура SCNT у собак поразительно похожа на применяемую у крупного рогатого скота и других видов (рисунок 82.12), невозможность получить значительное количество зрелых ооцитовin vitroобусловливает необходимость использования ооцитов, созревшихin vivo.²³Помимо того, что для собак характерна моноэстральность, особую трудность при выборе стадии созревания ооцитов для SCNT создаёт их созревание в яйцеводах после овуляции: этот процесс может продолжаться в течение 48–72 часов. Несмотря на успешное получение потомства после переноса клонированных эмбрионов в яйцеводы, низкая эффективность SCNT у собак в значительной степени связана с гибелью эмбрионов и плодов на ранних стадиях. Синдром аномального потомства, по-видимому, представляет проблему при клонировании собак. Как и у крупного рогатого скота, более тяжёлые плаценты были связаны с более низкой выживаемостью.²⁴У погибших клонированных плодов и потомства отмечены различные патологии, в том числе увеличенная мышечная масса.²⁵

Возможные факторы низкой эффективности клонирования методом SCNT

Если учесть неизбежное физическое повреждение при проведении SCNT и сложность взаимодействия факторов в цитоплазме ооцита, от которых «ожидают» перепрограммирования соматического ядра, поистине удивительно, что из некоторых клонов развиваются здоровые животные. Ряд процедурных аспектов многочисленных микроманипуляций, необходимых для создания клонированных эмбрионов из ооцитов и соматических клеток, далёк от идеала (см. рисунок 82.3). Удаление ядерной ДНК из ооцита обычно сопровождается физическим удалением 5–15% или более ооплазмы и её воздействием химического вещества, которое в иных обстоятельствах считалось бы «вредным». При проверке результатов этой процедуры ооплазма может подвергаться воздействию ультрафиолетового излучения, которое, как показано, нарушает целостность мембран, усиливает поглощение метионина и изменяет синтез белка и активность митохондрий.²⁶Для введения ядра соматической клетки в цитоплазму ооцита обычно используют электрически индуцированное слияние или микроинъекцию. Как бы осторожно ни выполнялась каждая из этих процедур, некоторая степень лизиса неизбежна. Кроме того, описаны различные протоколы активации клонированных эмбрионов, большинство из которых предусматривает воздействие химических веществ, в иных обстоятельствах считающихся вредными.

Кроме того, культивирование клонированных эмбрионов, полученных из ооцитов, созревшихin vitroперед переносом суррогатным самкам тоже не обходится без неблагоприятных последствий. Как и при SCNT, к осложнениям, свойственным получению эмбрионов методами IVMFC, относятся изменения экспрессии генов у эмбрионов на ранних стадиях развития и у плодов,²⁷повышенная частота абортов (~16%),¹⁶аномалии плаценты, повышенная частота гидроаллантоиса (~1%),¹⁵увеличенная масса плодов, затруднённые роды, синдром крупного потомства и смертность (~15%),^{15,16,28–32}хотя и с гораздо меньшей частотой (см. главу 67). Какие именно факторы SCNT усугубляют проблемы, присущие методам IVMFC, изучено недостаточно. Однако резкие различия между отдельными клеточными линиями по способности давать живое потомство после переноса ядра, причём показатели у некоторых приближаются к значениям,

достигаемым при использовании методов IVMFC (см. рисунок 82.5), указывают на неправильное или неполное перепрограммирование соматического ядра цитоплазмой ооцита. Так, характер метилирования генома в клонированных бластоцистах часто напоминает наблюдаемый в соматических клетках, что могло бы объяснить аномальную экспрессию важных для развития генов у клонированных эмбрионов и плодов.^33,34

Краткие итоги и выводы

Клонирование методом SCNT бросает вызов основным принципам биологии развития. Для полноценного применения SCNT в сельском хозяйстве и медицине человека крайне необходимо повысить количество и выживаемость клонированных эмбрионов, плодов и потомства. Учитывая сложность создания эмбриона лишь из соматического ядра и цитоплазмы ооцита, вероятно, потребуются ещё многие годы исследований, прежде чем этот процесс удастся понять достаточно хорошо, чтобы улучшить результаты.

Литература

1. Wilmut I, Schnieke A, McWhir J, Kind A, Campbell K. Жизнеспособное потомство, полученное из эмбриональных и взрослых клеток млекопитающих.Nature 1997;385:810–813.

2. Briggs R, King T. Пересадка живых ядер из клеток бластулы в яйцеклетки лягушек с удалёнными ядрами.Proc Natl Acad Sci USA 1952;38:455–463.

3. McGrath J, Solter D. Пересадка ядер в эмбрионе мыши с помощью микрохирургии и слияния клеток.Science 1983;220: 1300–1302.

4. Willadsen S. Пересадка ядер в эмбрионах овец.Nature 1986;320:63–65.

5. Prather R, Barnes F, Sims M, Robl J, Eyestone W, First N. Пересадка ядер в эмбрионах крупного рогатого скота: оценка донорских ядер и реципиентных ооцитов.Biol Reprod 1987;37:859–866.

6. Stice S, Robl J. Перепрограммирование ядер в эмбрионах кролика, полученных методом переноса ядра.Biol Reprod 1988;39:657–664.

7. Prather R, Sims M, First N. Пересадка ядер в эмбрионах свиней на ранних стадиях развития.Biol Reprod 1989;41:414–418.

8. Campbell K, McWhir J, Ritchie W, Wilmut I. Овца, клонированная путём переноса ядра из культивируемой клеточной линии. Nature 1996;380: 64–66.

9. Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств. Клонирование животных: оценка рисков, глава V, риски для здоровья животных, 2008. http://www. fda.gov/AnimalVeterinary/SafetyHealth/AnimalCloning/ ucm124840.htm. Дата обращения: 15 января 2013 г.

10. Wells D, Misica P, Tervit H, Vivanco W. Перенос ядра взрослой соматической клетки для сохранения последней выжившей коровы породы острова Эндерби. Reprod Fertil Dev 1998;10:369–378.

11. Lanza R, Cibelli J, Diaz F и др. Клонирование исчезающего вида (Bos gaurus) с использованием межвидового переноса ядер. Cloning 2000;2:79–90.

12. Schnieke A, Kind A, Ritchie W и др. Получение трансгенных овец, продуцирующих человеческий фактор IX, путём переноса ядер из трансфицированных фетальных фибробластов. Science 1997;278:2130–2133.

13. Hill J, Burghardt R, Jones K и др. Данные о том, что аномалии плаценты являются основной причиной гибели плодов крупного рогатого скота, клонированных из соматических клеток, в первом триместре беременности. Biol Reprod 2000;63:1787–1794.

14. Hawk H. Бесплодие у молочного крупного рогатого скота. Монтклер, штат Нью-Джерси: Allanheld, Osmun and Co. Publishing, 1979.

15. Hasler J. Современное состояние методов получения ооцитов, in vitro получения эмбрионов и их пересадки у домашних животных с особым вниманием к крупному рогатому скоту. J Anim Sci 1998;76(прил. 3):52–74.