Воспроизводство крупного рогатого скота

Корова/ плод

Венерический кампилобактериоз приводит к низкой эффективности воспроизводства с серьезными экономическими потерями.¹² Это связано с временным бесплодием с легким эндометритом, гибелью раннего эмбриона или раннего плода (30– 70 дней беременности) и спорадическими абортами.^13,14 После контакта бактерии колонизируются в слизистой оболочке передней части влагалища и шейки матки коров. Затем инфекция распространяется в матку и яйцеводы, находящиеся под воздействием прогестерона. Оплодотворение и развитие зародыша напрямую не зависит от C. fetus venerealis. К ранней эмбриональной смерти в результате приводит воспалительная реакция в матке и/или яйцеводах. Большая часть потерь беременности происходит между 30 и 70 днями гестации.^13,15 Считается, что реакции, связанные с термостабильными эндотоксинами, продуцируемыми C. fetus venerealis ответственны за спорадические аборты во втором триместре.⁴ Кроме того, C. fetus subsp. venerealis может достигать плаценты и околоплодных вод и вызывать тяжелый плацентит и гипоксию плода.¹⁶ Коровы и телки обычно способны усиливать иммунный ответ, очиститься от инфекции и возвращаются к нормальной фертильности через 4–8 месяцев после заражения.¹³

Клинические признаки

Стадо

Плохая оплодотворяемость, бесплодие или аборты во втором триместре в анамнезе стада могут быть одними из первых признаков того, что в стаде циркулирует венерический кампилобактериоз. Трихомониаз, плохая выявляемость эструса и субфертильность (пониженная плодовитость) или бесплодие быков также следует рассматривать как возможные дифференциальные диагнозы. Подтвердить диагноз венерического кампилобактериоза можно путем лабораторного анализа образцов, полученных от животных стада. Образцы для диагностики включают ткани от абортированных плодов, образцы слизи из влагалища, смывы влагалища или препуциальные соскобы.

Диагностическое обследование стада целесообразно начинать с племенных быков стада из-за меньшего их числа и самоограничивающегося типа инфекции, связанной с самками. Таким образом, от быков должны быть получены препуциальные соскобы. Если быков нет в наличии, то следует взять образцы слизи влагалища от репрезентативной выборки коров и телок и отправить в диагностическую лабораторию.

Корова

Иммунный ответ

Инфекция C. fetus subsp. venerealis у коров и быков не приводит к выработке значительного количества системных антител во время или после заражения.¹⁷ В отличие от быков, коровы и телки, инфицированные C. fetus venerealis формируют локальный антительный ответ во влагалище и матке. Телки, зараженные C. fetus venerealis имели транзитные агглютинирующие и иммобилизирующие антитела IgM, с последующим образованием постоянных антител IgA и IgG в секретах влагалища и преимущественно антител IgG в секретах матки.^17,18 Как IgA, так и IgG антитела к поверхностным антигенам C. fetus venerealis иммобилизуют и опосредуют уничтожение бактерий нейтрофильными и мононуклеарными клетками.¹⁹ Производство IgG в матке направляет клиренс через опсонизацию (процесс адсорбции опсонинов на поверхности микроорганизмов и других инородных частиц, который стимулирует и облегчает фагоцитоз данных частиц. Функцию опсонинов могут выполнять антитела или комплемент) и фагоцитоз. В расположенном ниже репродуктивном тракте также вырабатываются IgA, которые помогают иммобилизовать бактерии и блокировать их адгеренцию (прилипание, сцепление с клетками) . И наоборот, IgA также могут быть ответственны за блокирование опсонизации и могут способствовать постоянной колонизации нижних половых путей. Из-за более сильного иммунного ответа у коров и телок, инфекции у них не столь длительны и устойчивы, как у быков.^18,20 Однако, в случае, когда корова является хроническим носителем, бактерии могут избежать иммунного ответа и сохраняться в шейке матки в течение всего срока стельности, хотя такое встречается довольно редко (<1%).⁶ Персистенция инфекции в шейке матки и влагалище при наличии иммунного ответа может быть отчасти связана с антигенными изменениями в микроорганизме, которые позволяют избежать иммунного ответа хозяина. Антигенные изменения в S- слое, равномерный массив высокомолекулярных поверхностных белков с высокой молекулярной массой, которые составляют внешний слой клеточной оболочки, приводят к экспрессии различных иммунодоминантных эпитопов и персистенции микроорганизма.⁴

У самок основные клинические признаки связаны с бесплодием. Венерический кампилобактериоз характеризуется многократными осеменениями, нерегулярными эстральными циклами, продолжительными сезонами отела и сокращением выхода телят.^13,21 Среднее число осеменений на одну стельность увеличивается до 2,5– 3,5. Когда инфекция внедряется в наивное стадо, поначалу показатели оплодотворяемости сильно снижаются. Со временем процент зачатия по стаду улучшается, поскольку животные избавлются от инфекции. Тем не менее, в результате этого увеличивается продолжительность сезона отела, так как большинство коров оплодотворятся позже. Зараженные коровы проявляют мало признаков инфекции. У большинства из них нет выделений из влагалища. Однако, у единичных коров может быть обнаружена слизисто-гнойная секреция.⁴ Как указывалось ранее, большая часть потерь стельности происходит между 30 и 70 днями гестации.^13,15 Сообщалось, что аборт из-за C. fetus subsp хоть и редко, но все же встречается между 4 и 8 месяцами гестации.¹³ Аборты, по-видимому, чаще связаны с промежуточным (intermedius) биотипом, чем с венерическим (venerealis) биотипом. Сообщалось, что при абортах на среднем сроке из-за C. fetus venerealis, в стаде в последнее время наблюдалось бесплодие.⁴

Бык

Инфекция C. fetus subsp. venerealis у быков не проявляется, поскольку у быков нет клинических признаков. Хотя генитальные инфекции у зрелых быков могут длиться месяцами или годами, качество спермы не изменяется.^22–24

Патология

Патология, связанная с заражением C. fetus subsp. venerealis ограничена репродуктивным трактом. Эндометрит, легкий цервицит и сальпингит, как правило, являются единственными поражениями, наблюдаемыми у коров и телок.²⁵ В целом шейка может выглядеть покрасневшей, а в матке может быть небольшое количество слизистогнойного экссудата, который может распространяться через шейку матки во влагалище.

Гистологически поражения имеют слабую инфильтрацию воспалительных клеток (плазматических клеток и лимфоцитов из стромальных очагов) с незначительной десквамацией поверхностного эпителия без серьезных сосудистых изменений.²⁵ Вовлечение желез эндометрия минимально, хотя кистозные железы со слабым перигландулярным фиброзом были отмечены в период клиренса инфекции.²⁵

На половом члене и препуции инфицированных быков не наблюдается никаких серьезных нарушений. Гистологически внутри собственной пластинки имеется только диффузная инфильтрация мононуклеарных клеток.²² Плазматические клетки расположены в скоплениях на вершине дермальных сосочков.⁷ Однако, инфильтрация субэпителиальных лимфоцитов и плазматических клеток была обнаружена как у инфицированных, так и у неинфицированных быков.^22,24,26

Наиболее распространенные поражения плода, связанные с C. fetus venerealis - это нейтрофильная бронхопневмония и интерстициальная пневмония.¹⁶ Другие часто встречающиеся поражения включают несуппуративный (негнойный) интерстициальный энтерит, гепатит, перикардит, миозит, миокардит, серозит, редко абомазит и менингит.^16,27,28

Диагностика

Важно уметь дифференцировать C. fetus venerealis от C. fetus fetus. Естественная среда обитания для C. fetus fetus - кишечный тракт крупного рогатого скота, но он также может вызывать спорадические аборты.²⁹ Различия в эпидемиологии и клинической значимости этих бактерий делают обязательным их точное обнаружение. Традиционное средство для дифференциации обоих видов и рекомендуемый международный стандарт основаны на толерантности к 1% глицину;³⁰ C. fetus venerealis чувствителен к глицину, тогда как C. fetus fetus толерантен к глицину. Однако, характеристика толерантности к глицину может быть не совсем надежной для дифференциации двух подвидов, поскольку было продемонстрировано, что толерантность к глицину может быть приобретена путем трансдукции (процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом) или мутации.³¹ Кроме того, толерантные к глицину варианты C. fetus подвида venerealis также были описаны и обозначены как промежуточный биотип C. fetus подвида venerealis.^30,32 Также были обнаружены чувствительные к глицину изоляты C. fetus fetus.³³

Сбор образцов

Бык

Простой способ собрать препуциальную смегму - это взять препуциальный соскоб. Наиболее распространенный метод сбора препуциального соскоба заключается в использовании пластиковой пипетки для искусственного осеменения, что является быстрым, простым и недорогим.¹⁴ Наконечник пипетки для искусственного осеменения помещается в проксимальный препуциальный свод. Соскобы с крайней плоти следует производить довольно энергично, чтобы отделить эпителиальные клетки от полового члена и препуциальной поверхности и включают 10-15 движений. К дистальному концу пипетки ИО должен быть прикреплен шприц на 12 мл, и врач должен оказывать на пипетку отрицательное давление на протяжении всей процедуры взятия соскоба.¹⁴ После процедуры может наблюдаться небольшое кровотечение, но обычно это не наносит вред быку. Поскольку пипетка извлекается из препуциальной полости, отрицательное давление на пипетку следует осторожно снимать. Собранный должным образом образец представляет собой 2–5 см столбик мутной смегмы внутри пипетки.

До введения пипетки в препуциальную полость на нее можно надеть пластиковый чехол для минимизации загрязнения.

Корова

Образец слизи из краниальной части влагалища можно получить от коровы с помощью пипетки ИО с пластиковым чехлом, чтобы минимизировать загрязнение. Шприц на 12 мл помещают на дистальный конец пипетки для искусственного осеменения, которую затем вводят до краниального влагалищного свода коровы. На шприц оказывают отрицательное давление, в то время как пипетку осторожно перемещают внутри свода влагалища. Сбор образцов влагалищной слизи следует проводить во время течки. Культивирование образцов влагалищной слизи считается наиболее полезным в диагностическом отношении, когда образцы получены на ранних стадиях заражения до развития иммунитета.⁴

Плод

Образцы, которые должны быть собраны у абортированного плода, включают сычужную жидкость, легкое, печень, сердце, кишечник и плаценту. Сычужная жидкость от абортированных плодов является лучшим диагностическим образцом. Фетальные мембраны также могут быть полезны, но диагностика часто затруднена из-за контаминации бактериями.⁴

Транспортировка образцов

Обращение с образцами препуциальных соскобов, вагинальной слизи или образцами из абортированных плодов имеет решающее значение для точной диагностики C. fetus venerealis. Чтобы оптимизировать размножение микроорганизма, лучше всего доставить образцы в лабораторию в течение 6 часов после их отбора. Кампилобактерии требуют комплексной поддерживающей среды, противомикробных препаратов для подавления роста комменсалов и контаминантов, а также условий, приближенных к анаэробным.³⁴ Успех культивирования кампилобактерий напрямую связан с выбором и доступностью среды. Для выделения и культивирования C. fetus venerealis доступны несколько различных транспортных обогащенных сред (TОС). К ним относятся среда Вейбриджа, среда Кэри-Блэра, селективная среда Кларка, австралийская ТОС, среда Блейзера-Вана, транспортная среда Ландера, транспортные обогащенные среды CampyBac и Thomann.^3,14,35,36 Клиницистам лучше всего обращаться в свою местную диагностическую лабораторию для получения информации о предпочтительных средах и обработке образцов до сбора и передачи. Во многих случаях лаборатория будет поставлять транспортные среды и инструкции по их использованию. Находясь в ТОС, образец в некоторой степени защищен от небольших колебаний температуры. Если инокулированная (засеянная) ТОС должна находиться в пути более 4 часов, рекомендуется, чтобы образец не инкубировался при температуре выше комнатной, пока он не достигнет диагностической лаборатории.^14,37

Методы диагностики

Обнаружение антигена или антитела

Методы обнаружения антигена чаще всего используются для выявления активного носителя венерического кампилобактериоза у быков, в то время как обнаружение антител может быть более полезным для выявления данного микроорганизма у коров.

Системные антительные реакции не информативны, потому что они часто обусловлены непатогенными кампилобактериями. Одним из специфических методов обнаружения антител является тест на агглютинацию вагинальной слизи для выявления антител в препуциальных соскобах, влагалищной слизи или абортированных фетальных жидкостях.⁴⁰ Однако, изза низкой чувствительности теста для него лучше всего использовать образцы влагалищной слизи, отобранные между 37 и 70 днями после заражения.³ Кроме того, на специфичность этого теста может отрицательно влиять наличие крови или не связанное с инфекцией воспаление.⁴ Образец вагинальной слизи, который вызывает полную агглютинацию в разведении 1: 25, считается положительным диагнозом.⁴

Специфические антитела IgG были обнаружены с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) для измерения гуморального иммунного ответа у крупного рогатого скота после вакцинации против C. fetus.^41,42 ELISA также использовался для обнаружения антител IgA в слизистой влагалища у коров после аборта.⁴³ Кроме того, в качестве скрининг-теста для выявления C. fetus venerealis в препуциальных соскобах и образцах влагалищной слизи был разработан ELISA на основе моноклональных антител.^44,45

Изоляция культуры

Кампилобактерии нелегко культивировать и изолировать, потому что они привередливы и предъявляют особые требования для роста в среде.^3,46 После поступления в лабораторию, ТОС наносят на селективную среду и инкубируют в микроаэрофильной атмосфере (6% O2, 7% CO2, 7% H2, 80% N2) при 37 °C. Чашки со средой следует инкубировать в течение не менее 6 дней, прежде чем считать их отрицательными (без бактерий) . Во многих случаях колонии C. fetus venerealis станут видны в течение 3-х дней после посева. Колонии круглые, приподнятые, диаметром 1–3 мм. Эти колонии могут первоначально казаться прозрачными, но становятся непрозрачными при дальнейшей инкубации. Для идентификации чаще всего используются фенотипические характеристики. Изоляты Campylobacter fetus venerealis являются оксидаза-позитивными, каталаза-позитивными, устойчивыми к налидиксовой кислоте, но чувствительными к цефалотину, и растут при 25 °С, но не более 42 °С. Крайне важно различать C. fetus venerealis и C. fetus fetus из-за возможного загрязнения образца. Эти два подвида C. fetus отличаются только тем, что C. fetus venerealis не растет в присутствии 1% глицина, тогда как C. fetus fetus растет в 1% глицине.⁴ Как упоминалось ранее, характеристика толерантности к глицину может быть не совсем надежной для дифференциации двух подвидов, так как было продемонстрировано, что толерантность к глицину может быть приобретена путем трансдукции или мутации.³¹

Непосредственное исследование с помощью темнопольной микроскопии и окрашивание по Граму сычужного содержимого от абортированных плодов может быть полезным дополнительным инструментом для диагностики абортов, вызванных C. fetus venerealis. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать морфологические признаки и подвижность C. fetus. Окрашивание по Граму выявляет грамотрицательные палочки в форме запятой или в S-формы, которые выглядят как «крылья чайки».^2,3

Кампилобактерии легче визуализировать посредством окрашивания по Граму, если контрастировать с карболфухсином, а не со стандартным красителем с сафранином.^2–4 Темнопольная микроскопия и окрашивание по Граму для других образцов могут быть не столь полезны.

ПЦР

Молекулярные методы дифференциации подвидов C. fetus venerealis и C. fetus fetus были разработаны для подтверждения результатов оценки фенотипических различий во избежание ошибочной идентификации.²⁹ В большинстве этих ПЦР-анализов используются колонии, выращенные из культивируемой влагалищной слизи или препуциальных соскобов.¹⁴ Однако, транспортная среда Томана и обогащенная среда были разработаны для увеличения роста C. fetus venerealis и позволяют прямую ПЦРамплификацию из среды, если произойдет чрезмерный рост контаминантов.³⁶ Дифференциация видов C. fetus достигается с помощью специфического анализа ПЦР.⁴⁷ В этом анализе используется видоспецифичный ампликон размером 764 п.н., который продуцируется праймерами MG3F и MG4R с ДНК обоих видов C. fetus. Впоследствии праймеры VenSF и VenSR используются для дифференцировки. Идентификация C. fetus venerealis основана на присутствии ампликона в 142 п.н., который не образуется C. fetus fetus.⁴⁷ Однако, надежность этого ПЦР-анализа была поставлена под сомнение³⁰ из-за ошибочной идентификации до 10% штаммов.⁴⁸ Поэтому этот ПЦР-анализ лучше всего использовать для подтверждения тр адиционной оценки фенотипических характеристик C. fetus. Другие исследования были сосредоточены на использовании мультиплексной ПЦР для дифференциации C. fetus spp.⁴⁸ Мультиплексная ПЦР состоит из нескольких наборов праймеров в одной ПЦР-смеси. Эти наборы праймеров продуцируют ампликоны различных размеров, которые специфичны для различных последовательностей ДНК, которые наблюдаются в виде отдельных полос при визуализации с помощью гель-электрофореза. Однако, использование мультиплексной ПЦР потребует дальнейшей проверки в случае присутствия в образце более широкого пула клональных штаммов.^49,50 Клонирование и секвенирование нуклеотидов, как с ПЦР, так и без нее, становятся все более эффективными методами при генотипировании бактериальных изолятов.⁵¹ Фактически был разработан новый 5'-Taq-нуклеазный ПЦР-анализ с использованием 3'-ДНК-зонда с малой бороздкой ( ДНК-зонд - фрагмент ДНК, меченный тем или иным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. Позволяет идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности.) для прямого обнаружения C. fetus venerealis в клинических образцах крупного рогатого скота.⁵² В молекулярных методах для дифференциации двух подвидов C. fetus также использовали открытие геномной последовательности размером 80 кб (состоящей из компонентов системы секреции IV типа [T4SS], предполагаемых плазмидных генов, других белков) и инсерционный элемент (ISCfe1), уникальный для C. fetus venerealis.^53,54

Профилактика, контроль и лечение

Профилактика

Программы вакцинации являются наиболее эффективным средством профилактики кампилобактериоза в стадах крупного рогатого скота и должны охватывать как быков, так и коров с телками.¹³ Первичная иммунизация самок требует двух инъекций бактерина, при этом вторая инъекция должна быть введена за 3 недели до осеменения. Ежегодную ревакцинацию также следует проводить за 3 недели до осеменения.¹⁴ Такой предслучной план вакцинации повышает уровень антител (IgG1 и IgG2) в тот период, когда заражение наиболее вероятно, и помогает защитить от маточной инфекции.¹⁴