Воспроизводство крупного рогатого скота

Гистологически поражения имеют слабую инфильтрацию воспалительных клеток (плазматических клеток и лимфоцитов из стромальных очагов) с незначительной десквамацией поверхностного эпителия без серьезных сосудистых изменений.²⁵ Вовлечение желез эндометрия минимально, хотя кистозные железы со слабым перигландулярным фиброзом были отмечены в период клиренса инфекции.²⁵

На половом члене и препуции инфицированных быков не наблюдается никаких серьезных нарушений. Гистологически внутри собственной пластинки имеется только диффузная инфильтрация мононуклеарных клеток.²² Плазматические клетки расположены в скоплениях на вершине дермальных сосочков.⁷ Однако, инфильтрация субэпителиальных лимфоцитов и плазматических клеток была обнаружена как у инфицированных, так и у неинфицированных быков.^22,24,26

Наиболее распространенные поражения плода, связанные с C. fetus venerealis - это нейтрофильная бронхопневмония и интерстициальная пневмония.¹⁶ Другие часто встречающиеся поражения включают несуппуративный (негнойный) интерстициальный энтерит, гепатит, перикардит, миозит, миокардит, серозит, редко абомазит и менингит.^16,27,28

Диагностика

Важно уметь дифференцировать C. fetus venerealis от C. fetus fetus. Естественная среда обитания для C. fetus fetus - кишечный тракт крупного рогатого скота, но он также может вызывать спорадические аборты.²⁹ Различия в эпидемиологии и клинической значимости этих бактерий делают обязательным их точное обнаружение. Традиционное средство для дифференциации обоих видов и рекомендуемый международный стандарт основаны на толерантности к 1% глицину;³⁰ C. fetus venerealis чувствителен к глицину, тогда как C. fetus fetus толерантен к глицину. Однако, характеристика толерантности к глицину может быть не совсем надежной для дифференциации двух подвидов, поскольку было продемонстрировано, что толерантность к глицину может быть приобретена путем трансдукции (процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом) или мутации.³¹ Кроме того, толерантные к глицину варианты C. fetus подвида venerealis также были описаны и обозначены как промежуточный биотип C. fetus подвида venerealis.^30,32 Также были обнаружены чувствительные к глицину изоляты C. fetus fetus.³³

Сбор образцов

Бык

Простой способ собрать препуциальную смегму - это взять препуциальный соскоб. Наиболее распространенный метод сбора препуциального соскоба заключается в использовании пластиковой пипетки для искусственного осеменения, что является быстрым, простым и недорогим.¹⁴ Наконечник пипетки для искусственного осеменения помещается в проксимальный препуциальный свод. Соскобы с крайней плоти следует производить довольно энергично, чтобы отделить эпителиальные клетки от полового члена и препуциальной поверхности и включают 10-15 движений. К дистальному концу пипетки ИО должен быть прикреплен шприц на 12 мл, и врач должен оказывать на пипетку отрицательное давление на протяжении всей процедуры взятия соскоба.¹⁴ После процедуры может наблюдаться небольшое кровотечение, но обычно это не наносит вред быку. Поскольку пипетка извлекается из препуциальной полости, отрицательное давление на пипетку следует осторожно снимать. Собранный должным образом образец представляет собой 2–5 см столбик мутной смегмы внутри пипетки.

До введения пипетки в препуциальную полость на нее можно надеть пластиковый чехол для минимизации загрязнения.

Корова

Образец слизи из краниальной части влагалища можно получить от коровы с помощью пипетки ИО с пластиковым чехлом, чтобы минимизировать загрязнение. Шприц на 12 мл помещают на дистальный конец пипетки для искусственного осеменения, которую затем вводят до краниального влагалищного свода коровы. На шприц оказывают отрицательное давление, в то время как пипетку осторожно перемещают внутри свода влагалища. Сбор образцов влагалищной слизи следует проводить во время течки. Культивирование образцов влагалищной слизи считается наиболее полезным в диагностическом отношении, когда образцы получены на ранних стадиях заражения до развития иммунитета.⁴

Плод

Образцы, которые должны быть собраны у абортированного плода, включают сычужную жидкость, легкое, печень, сердце, кишечник и плаценту. Сычужная жидкость от абортированных плодов является лучшим диагностическим образцом. Фетальные мембраны также могут быть полезны, но диагностика часто затруднена из-за контаминации бактериями.⁴

Транспортировка образцов

Обращение с образцами препуциальных соскобов, вагинальной слизи или образцами из абортированных плодов имеет решающее значение для точной диагностики C. fetus venerealis. Чтобы оптимизировать размножение микроорганизма, лучше всего доставить образцы в лабораторию в течение 6 часов после их отбора. Кампилобактерии требуют комплексной поддерживающей среды, противомикробных препаратов для подавления роста комменсалов и контаминантов, а также условий, приближенных к анаэробным.³⁴ Успех культивирования кампилобактерий напрямую связан с выбором и доступностью среды. Для выделения и культивирования C. fetus venerealis доступны несколько различных транспортных обогащенных сред (TОС). К ним относятся среда Вейбриджа, среда Кэри-Блэра, селективная среда Кларка, австралийская ТОС, среда Блейзера-Вана, транспортная среда Ландера, транспортные обогащенные среды CampyBac и Thomann.^3,14,35,36 Клиницистам лучше всего обращаться в свою местную диагностическую лабораторию для получения информации о предпочтительных средах и обработке образцов до сбора и передачи. Во многих случаях лаборатория будет поставлять транспортные среды и инструкции по их использованию. Находясь в ТОС, образец в некоторой степени защищен от небольших колебаний температуры. Если инокулированная (засеянная) ТОС должна находиться в пути более 4 часов, рекомендуется, чтобы образец не инкубировался при температуре выше комнатной, пока он не достигнет диагностической лаборатории.^14,37

Методы диагностики

Обнаружение антигена или антитела

Методы обнаружения антигена чаще всего используются для выявления активного носителя венерического кампилобактериоза у быков, в то время как обнаружение антител может быть более полезным для выявления данного микроорганизма у коров.

Системные антительные реакции не информативны, потому что они часто обусловлены непатогенными кампилобактериями. Одним из специфических методов обнаружения антител является тест на агглютинацию вагинальной слизи для выявления антител в препуциальных соскобах, влагалищной слизи или абортированных фетальных жидкостях.⁴⁰ Однако, изза низкой чувствительности теста для него лучше всего использовать образцы влагалищной слизи, отобранные между 37 и 70 днями после заражения.³ Кроме того, на специфичность этого теста может отрицательно влиять наличие крови или не связанное с инфекцией воспаление.⁴ Образец вагинальной слизи, который вызывает полную агглютинацию в разведении 1: 25, считается положительным диагнозом.⁴

Специфические антитела IgG были обнаружены с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) для измерения гуморального иммунного ответа у крупного рогатого скота после вакцинации против C. fetus.^41,42 ELISA также использовался для обнаружения антител IgA в слизистой влагалища у коров после аборта.⁴³ Кроме того, в качестве скрининг-теста для выявления C. fetus venerealis в препуциальных соскобах и образцах влагалищной слизи был разработан ELISA на основе моноклональных антител.^44,45

Изоляция культуры

Кампилобактерии нелегко культивировать и изолировать, потому что они привередливы и предъявляют особые требования для роста в среде.^3,46 После поступления в лабораторию, ТОС наносят на селективную среду и инкубируют в микроаэрофильной атмосфере (6% O2, 7% CO2, 7% H2, 80% N2) при 37 °C. Чашки со средой следует инкубировать в течение не менее 6 дней, прежде чем считать их отрицательными (без бактерий) . Во многих случаях колонии C. fetus venerealis станут видны в течение 3-х дней после посева. Колонии круглые, приподнятые, диаметром 1–3 мм. Эти колонии могут первоначально казаться прозрачными, но становятся непрозрачными при дальнейшей инкубации. Для идентификации чаще всего используются фенотипические характеристики. Изоляты Campylobacter fetus venerealis являются оксидаза-позитивными, каталаза-позитивными, устойчивыми к налидиксовой кислоте, но чувствительными к цефалотину, и растут при 25 °С, но не более 42 °С. Крайне важно различать C. fetus venerealis и C. fetus fetus из-за возможного загрязнения образца. Эти два подвида C. fetus отличаются только тем, что C. fetus venerealis не растет в присутствии 1% глицина, тогда как C. fetus fetus растет в 1% глицине.⁴ Как упоминалось ранее, характеристика толерантности к глицину может быть не совсем надежной для дифференциации двух подвидов, так как было продемонстрировано, что толерантность к глицину может быть приобретена путем трансдукции или мутации.³¹

Непосредственное исследование с помощью темнопольной микроскопии и окрашивание по Граму сычужного содержимого от абортированных плодов может быть полезным дополнительным инструментом для диагностики абортов, вызванных C. fetus venerealis. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать морфологические признаки и подвижность C. fetus. Окрашивание по Граму выявляет грамотрицательные палочки в форме запятой или в S-формы, которые выглядят как «крылья чайки».^2,3

Кампилобактерии легче визуализировать посредством окрашивания по Граму, если контрастировать с карболфухсином, а не со стандартным красителем с сафранином.^2–4 Темнопольная микроскопия и окрашивание по Граму для других образцов могут быть не столь полезны.

ПЦР

Молекулярные методы дифференциации подвидов C. fetus venerealis и C. fetus fetus были разработаны для подтверждения результатов оценки фенотипических различий во избежание ошибочной идентификации.²⁹ В большинстве этих ПЦР-анализов используются колонии, выращенные из культивируемой влагалищной слизи или препуциальных соскобов.¹⁴ Однако, транспортная среда Томана и обогащенная среда были разработаны для увеличения роста C. fetus venerealis и позволяют прямую ПЦРамплификацию из среды, если произойдет чрезмерный рост контаминантов.³⁶ Дифференциация видов C. fetus достигается с помощью специфического анализа ПЦР.⁴⁷ В этом анализе используется видоспецифичный ампликон размером 764 п.н., который продуцируется праймерами MG3F и MG4R с ДНК обоих видов C. fetus. Впоследствии праймеры VenSF и VenSR используются для дифференцировки. Идентификация C. fetus venerealis основана на присутствии ампликона в 142 п.н., который не образуется C. fetus fetus.⁴⁷ Однако, надежность этого ПЦР-анализа была поставлена под сомнение³⁰ из-за ошибочной идентификации до 10% штаммов.⁴⁸ Поэтому этот ПЦР-анализ лучше всего использовать для подтверждения тр адиционной оценки фенотипических характеристик C. fetus. Другие исследования были сосредоточены на использовании мультиплексной ПЦР для дифференциации C. fetus spp.⁴⁸ Мультиплексная ПЦР состоит из нескольких наборов праймеров в одной ПЦР-смеси. Эти наборы праймеров продуцируют ампликоны различных размеров, которые специфичны для различных последовательностей ДНК, которые наблюдаются в виде отдельных полос при визуализации с помощью гель-электрофореза. Однако, использование мультиплексной ПЦР потребует дальнейшей проверки в случае присутствия в образце более широкого пула клональных штаммов.^49,50 Клонирование и секвенирование нуклеотидов, как с ПЦР, так и без нее, становятся все более эффективными методами при генотипировании бактериальных изолятов.⁵¹ Фактически был разработан новый 5'-Taq-нуклеазный ПЦР-анализ с использованием 3'-ДНК-зонда с малой бороздкой ( ДНК-зонд - фрагмент ДНК, меченный тем или иным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. Позволяет идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности.) для прямого обнаружения C. fetus venerealis в клинических образцах крупного рогатого скота.⁵² В молекулярных методах для дифференциации двух подвидов C. fetus также использовали открытие геномной последовательности размером 80 кб (состоящей из компонентов системы секреции IV типа [T4SS], предполагаемых плазмидных генов, других белков) и инсерционный элемент (ISCfe1), уникальный для C. fetus venerealis.^53,54

Профилактика, контроль и лечение

Профилактика

Программы вакцинации являются наиболее эффективным средством профилактики кампилобактериоза в стадах крупного рогатого скота и должны охватывать как быков, так и коров с телками.¹³ Первичная иммунизация самок требует двух инъекций бактерина, при этом вторая инъекция должна быть введена за 3 недели до осеменения. Ежегодную ревакцинацию также следует проводить за 3 недели до осеменения.¹⁴ Такой предслучной план вакцинации повышает уровень антител (IgG1 и IgG2) в тот период, когда заражение наиболее вероятно, и помогает защитить от маточной инфекции.¹⁴

Многие различные вакцины против C. fetus доступны для использования у крупного рогатого скота, включая вакцины как с масляным адъювантом, так и абсорбированные гидроксидом алюминия.¹³ Бактерины в масляном адъюванте более эффективны и обеспечивают более длительный иммунитет и защиту после однократного введения.⁵⁵ В исследовании, проведенном в стадах в Аргентине, две коммерческие вакцины, абсорбированные гидроксидом алюминия были признаны неэффективными в предотвращении репродуктивных потерь из-за C. fetus.^13,56 Однократное подкожное введение телкам вакцины против кампилобактериоза с масляным адъювантом продемонстрировало защиту от репродуктивных потерь. Однако вакцины с масляным адъювантом вызывают локализованные гранулемы и гранулемы в месте инъекции.¹³

Вибрин (Pfizer Animal Heath) - единственный в США бактерицидный препарат против C. fetus с добавлением масла, который был исследован на быках.¹³ Две дозы по 5-мл, что в 2,5 раза превышает дозу, рекомендованную для вакцинации коров, следует вводить подкожно племенным быкам с 4-недельным интервалом, начиная за 8 недель до случного сезона. Ежегодная ревакцинация в той же дозе рекомендуется за 4 недели до случного сезона.^13,57

Контроль

Ликвидация естественного осеменения и использование ИО - лучшее средство борьбы с венерическим кампилобактериозом крупного рогатого скота. Тем не менее, производители часто считают эту рекомендацию слишком трудной, чтобы следовать ей. Если используется ИО, сперма должна быть должным образом проверена на C. fetus venerealis и содержать антибиотик в разбавителе, чтобы гарантировать, что контаминированная сперма не приведет к реинтродукции бактерии в стадо. Если ИО невозможно, то предыдущая группа быков должна быть заменена молодыми быками, ранее не участвовавшими в разведении.¹⁴

Лечение

Из-за отсутствия доступности и эффективности некоторых антибиотиков (стрептомицин), стандартное лечение животных, инфицированных C. fetus venerealis сосредоточилось на устранения инфекции посредством иммунотерапии, которая включает иммунизацию животных соответствующим адъювантным антигеном. Систематическая иммунизация коров, которые были активно или пассивно иммунизированы C. fetus venerealis вылечила этих животных от состояния вагинального носительства.^24,58,59 Кроме того, систематическая иммунизация может также излечить или устранить инфекцию в течение 9 недель или более у некоторых быков, инфицированных C. fetus venerealis.^23,60,61 Иммунизация индуцирует как локальную, так и системную выработку антител IgG, которая предотвращает адгеренцию (прилипание) микробов, обездвиживает бактерии, активирует комплемент и опсонизирует бактерии для фагоцитоза.²⁴ Чаще всего для терапевтической иммунотерапии используются вакцинные препараты с масляным адьювантом.

Ссылки

1. Timoney JF, Gillespie JH, Scott FW, Barlough JE. Род Campylobacter . В кн.: Микробиология инфекционных болезней домашних животных Хагана и Брунера , 8-е изд. Итака, штат Нью-Йорк: Cornell University Press, 1988, с. 153–160.

2. Mshelia G, Amin J, Woldehiwet R, Murray R, Egwu G. Эпидемиология генитального кампилобактериоза крупного рогатого скота: географическое распространение и последние достижения в области молекулярных методов диагностики. Reprod Domest Anim 2010;45:e221–e230.

3. Walker R. Генитальный кампилобактериоз крупного рогатого скота. В кн.: Howard JL, Smith RA (ред.) Современная ветеринарная терапия 4: лечение сельскохозяйственных животных . Филадельфия: WB Saunders, 1999, с. 323–326.

4. Office International des Epizooties, 2005. Кампилобактериоз. Центр продовольственной безопасности и общественного здравоохранения. Институт международного сотрудничества в области биологических препаратов для животных, Колледж ветеринарной медицины Университета штата Айова, Эймс, штат Айова. Доступно по адресу http://www.cfsph.iastate.edu/ (декабрь 2012).

5. Dekeyser P. Генитальный кампилобактериоз крупного рогатого скота. В кн.: Morrow DA (ред.) Современные методы лечения в териогенологии , 2-е изд. Филадельфия: WB Saunders, 1986, с. 263–266.

6. Bier P, Hall C, Duncan J, Winter A. Экспериментальное заражение Campylobacter fetus быков разного возраста. Vet Microbiol 1977;2:13–27.

7. Wagner W, Dunn H, Vanvleck L. Частота вибриоза на станции искусственного осеменения. Cornell Vet 1965;55:209–220.

8. Strickland L, Wolfe D, Carson R и соавт. . Поверхностная анатомия эпителия полового члена и препуция быков. Clin Theriogenol 2011;3:362 (аннотация).

9. Mshelia M, Singh J, Amin J, Woldehiwet Z, Egwu G, Murray R. Генитальный кампилобактериоз крупного рогатого скота: обзор. CAB Rev Perspect Agr Vet Sci Nutr Nat Resources 2007;2:080. Доступно по адресу http://www.cabi.org/cabreviews/?page=4051&reviewid=800 00&site=167

10. Roberts J. Бесплодие у коров. В кн.: Roberts S (ред.) Ветеринарное акушерство и болезни половых органов (териогенология) , 2-е изд. Вудсток, Вермонт: издано автором, 1971, с. 376–506.

11. Campero C. Репродуктивные болезни крупного рогатого скота: вчера и сегодня. Acad Nac Agron Vet An 2000;53:88–112.

12. Givens M. Клинический подход к инфекционным причинам бесплодия мясного крупного рогатого скота, основанный на доказательствах. Theriogenology 2006;66: 648–654.

13. BonDurant R. Болезни крупного рогатого скота, передающиеся половым путём: естественное течение, диагностика и роль вакцин в их профилактике. Vet Clin North Am Food Anim Pract 2005;21:383–408.

14. Peter D. Болезни крупного рогатого скота, передающиеся половым путём. В кн.: Youngquist RS (ред.) Современная терапия в териогенологии крупных животных . Филадельфия: WB Saunders, 1997, с. 355–363.

15. Morrell E, Barbeito C, Odeon C, Gimeno E, Campero C. Гистопатологические, иммунологические, лектиногистохимические и молекулярные данные при самопроизвольных абортах у коров, вызванных Campylobacter fetus . Reprod Domest Anim 2011;46:309–315.

16. Corbeil L, Schurig G, Duncan J, Wilkie B, Winter A. Иммунитет в репродуктивном тракте коров на примере ответа на Campylobacter fetus . Adv Exp Med Biol 1981;137:729–743.

17. Corbeil L, Schurig G, Duncan J, Corbeil R, Winter A. Классы иммуноглобулинов и биологические функции антител к Campylobacter (Vibrio) fetus в сыворотке крови и цервиковагинальной слизи. Infect Immun 1974;10:422–429.

18. Corbeil L, Corbeil R, Winter A. Генитальный вибриоз крупного рогатого скота: активность воспалительных клеток в защитном иммунитете. Am J Vet Res 1975;36:403–406.

19. Schurig G, Hall C, Corbell L, Duncan J, Winter A. Генитальный вибриоз крупного рогатого скота: излечение генитальной инфекции у самок посредством системной иммунизации. Infect Immun 1975;11:245–251.

20. Zemjanis R. Вакцинация для повышения репродуктивной эффективности крупного рогатого скота. J Am Vet Med Assoc 1974;165:689–692.

21. Karmali M, Skirrow M. Таксономия рода Campylobacter . В кн.: Butzler JP (ред.) Кампилобактерная инфекция человека и животных . Бока-Ратон, Флорида: CRC Press, 1984, с. 1.

22. Bier P, Hall C, Duncan J, Winter A. Определение содержания иммуноглобулинов в секрете репродуктивного тракта быков. Vet Microbiol 1977;2:1–12.