Воспроизводство крупного рогатого скота

Таблица 63.1 Грибы были выделены в Северной Америке из 369 образцов, в культуре которых был получен один изолят.

Источник: адаптировано из Knudtson WU, Kirkbride CA. Грибы, связанные с абортами у крупного рогатого скота в штатах северных равнин США. J Vet Diagn Invest 1992;4:181–185.

Патогенез и патология

Наиболее вероятными путями воздействия грибков, вызывающих микотический плацентит и аборт, являются дыхательные пути и желудочно-кишечный тракт.⁸ Внутриматочная инокуляция конидий Aspergillus оказалась безуспешной в экспериментальной индукции микотического аборта, и поэтому восходящее инфекцирование репродуктивного тракта кажется маловероятным.⁹ Кроме того, микотические аборты были экспериментально вызваны внутривенным введением микроконидии Aspergillus, и гематогенный путь, как полагают, является путем заражения, потому что поражения первоначально развиваются в плацентомах.⁸ Грибки могут попадать в кровообращение через альвеолярные перегородки или через желудочно-кишечные поражения, возникающие в результате пенетрации через слизистые барьеры рубца, ретикулярной или омазальной (книжка) инфекции или язвы. Как только инфекция установлена в плацентомах, она продвигается латерально в межкотиледонные пространства. Плацента становится сильно утолщенной, с кожно-подобным видом межкотиледонных промежутков. Имеет место некроз котиледонов и карункулярных тканей и утолщения на краях карункула, придающие им вогнутый или выпуклый вид. При заражении Aspergillus spp. на плаценте могут быть сухие, толстые, желтые бляшки, покрывающие межкотиледонные области и большинство котиледонов.¹⁰ (рис. 63.1).

Тяжелый плацентарный некротический васкулит с тромбозом является отличительным признаком микотического аборта. Тем не менее, плацентарные поражения с похожим внешним видом могут быть вызваны бруцеллезом и генитальным кампилобактериозом. Впоследствии может произойти инфицирование плода с вовлечением кожи, легких, мозга или печени. Смерть плода обычно связывают с плацентарной недостаточностью. Повреждения кожи обычно проявляются в виде сухих, морщинистых, выпуклых бляшек с Aspergillus spp.; напротив, плод может выглядеть влажным при заражении зигомицетами. Плод изгоняется вскоре после смерти, что чаще всего происходит между 6 и 8 месяцами стельности. Часто плацента сохраняется, и котиледоны остаются прочно прикрепленными к материнским карункулам, которые могут разрываться в районе ножки. Последнее чаще всего наблюдается при зигомикотическом аборте и впоследствии может привести к вторичным инфекциям.⁵ При отсутствии серьезных повреждений матки большинство коров выздоравливают и в дальнейшем имеют нормальную беременность.

Приблизительно в 25% случаев абортов, вызванных зигомицетом Mortierella wolfii отмечается тяжелая послеабортная пневмония.⁷ После аборта, карункулы и матка могут высвобождать большое количество инфекционных элементов, что приводит к острой грибковой эмболической пневмонии.

Коровы обычно умирают в течение 72 часов после появления клинических признаков, включающих учащенное поверхностное дыхание с принудительным выдохом.¹¹ При инфицировании плода M. wolfii обычно поражаются печень и мозг, в отличие от инфекций, вызываемых другими грибами.¹²

Диагностика

Диагностика микотического аборта может проводиться с помощью макроскопических, микроскопических, гистопатологических или культуральных (посев) методов исследования. Кроме того, для идентификации специфических грибковых агентов использовалась молекулярная детекция (выявление) генетических последовательностей.¹³ Окончательный диагноз обычно ставится на основании положительного результата нескольких из этих методов. Предварительный диагноз можно поставить, опираясь на визуальное обнаружение микроскопическими методами грибковых гиф и элементов в тканях и жидкостях плаценты или плода в сочетании с характерными грубыми поражениями. Гистопатология в сочетании с культуральными или молекулярными методами позволяет окончательно подтвердить этиологический агент, ответственный за аборт.

Образцы

Образцы для диагностики микотического аборта могут быть использованы для общего исследования, прямого микроскопического и гистопатологического исследования, грибкового культивирования и молекулярной детекции. Образцы могут включать плаценту, плод, кожу плода, легкие плода и желудочную жидкость плода. Поскольку точность диагностики микотического аборта часто зависит от подтверждения несколькими методами, как правило, требуется полный перечень представленных образцов. Образцы должны быть осторожно отобраны и для каждого из используемых методов собраны отдельно. Следует проявлять крайнюю осторожность, чтобы избежать контаминации образцов, используемых для культивирования или молекулярной детекции, что может легко привести к ложноположительным результатам.

Плацента является наиболее часто используемым и информативным препаратом в диагностике грибковых абортов. Поскольку поражения микотическим плацентитом могут быть очаговыми и не затрагивать некоторые области, для исследования следует предоставить всю плаценту. Котиледоны с тканями карункула содержат наибольшее количество организмов и считаются лучшим образцом. Плацента всегда будет вовлечена в микотический аборт; однако, плод или ткани плода не подвержены постоянному воздействию.

После аборта плод может легко контаминироваться при контакте с окружающей средой. Приблизительно в 25% случаев микотических абортов кожа плода инфицирована, а поражения представлены в виде ограниченных, слегка приподнятых, кожистых, сероватожелтых бляшек. Эти поражения могут объединяться в более крупные образования, расположенные вдоль спины, верхней части головы и основания хвоста. Хотя после аборта амниотическая жидкость обычно недоступна, она будет содержать грибковые элементы, которые при повреждении кожи будут транспортироваться в другие части плода и ткани, которые не так легко контаминируются.^10,14

Желудочная жидкость - широко используемый образец для культурального исследования и молекулярной детекции, в изгнания плода и загрязнения его поверхности. Желудочная жидкость также может быть использована в качестве превосходного образца для прямой микроскопии. Также, воздействию околоплодных вод подвергаются легкие плода, которые часто используют в качестве образца в случае загрязненной поверхности плода при использовании диагностических методов амплификации (процесс образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК) .

Микроскопическое и гистопатологическое исследование

Прямое микроскопическое исследование плаценты, кожи плода и сычужной жидкости после их расщепления в 10–15% растворе КОН (едкий калий, щелочь) может выявить грибковые гифы. Расщепление дебриса хозяина зависит от времени и температуры и может быть ускорено с помощью слабого тепла. Прямая визуализация грибковых элементов может быть улучшена путем включения белого калькофлюора в 10%-ный раствор КОН, который специфически связывает целлюлозу и хитин клеточной стенки гриба. Белый калькофлюор (или Uvitex B, Blankophor) флуоресцирует сине-белым или яблочно-зеленым при воздействии ультрафиолетового света.^15–17 Кроме того, в раствор KOH можно добавить перманентные синие чернила Parker (10%), чтобы придать контраст и улучшить визуализацию гиалиновых гифальных элементов. Краситель лактофенол хлопковый синий может использоваться как простое положительное окрашивание образцов желудочной жидкости, для которых не обязательна щелочная обработка.

Микроскопическая морфология и характеристики грибов могут помочь в идентификации и подтверждении культурального изолята. Гифы зигомицетов относительно широкие (5–20 мкм), тонкостенные и ценоцитные (несептированные).¹⁸ На почкующиеся дрожжи с узкими основаниями и широкими псевдогифами, имеющими сжатые перегородки, могут указывать патогенные виды Candida.¹⁹ Дематиазные грибки, вызывающие аборты, имеют внутриклеточный пигмент коричневого или черного цвета (меланин), который хорошо виден. Виды Aspergillus имеют относительно узкие (2–6 мкм) гифы и частые перегородки, охватывающие параллельные стенки.¹⁰ Важно отметить, что идентификация на уровне видов с помощью прямых микроскопических методов невозможна, но эти методы можно оперативно использовать для подтверждения предполагаемого диагноза микотического аборта, выявления группы ответственных за аборт грибов и исключения других причин аборта.

Если весь плод не представлен в лабораторию, то следует отобрать подходящие области и участки плаценты, кожи и легких плода в 10% буферный нейтральный формалин для гистопатологии. В рутинных гистопатологических срезах, окрашенных гематоксилинэозином, гиалиновые грибковые элементы плохо визуализируются. Поэтому следует запросить специальное окрашивание предметных стекол Шифф-периоидной кислотой или метенаминовым серебром по Гомори, если есть подозрение на микотический аборт.

Методы культивирования грибов и молекулярная идентификация

Из-за повсеместного распространения грибов в естественной среде результаты культивирования следует интерпретировать с осторожностью. Контаминация образцов от абортированных плодов является частым явлением. По этой причине обычно ищут образцы легкого плода и жидкости или содержимого сычуга. Морфология и характеристики грибов, выращенных в культуре, должны соответствовать результатам прямой микроскопии и гистопатологии. Распространенной средой для культивирования и выделения грибов является декстрозный агар Сабуро (SDA) с добавлением и без добавления антибиотиков. Антибиотики, например, хлорамфеникол и циклогексимид, обычно включают в среду, такую как микобиотический агар (Difco), для подавления роста бактерий и сапрофитных грибов соответственно. При выборе сред необходимо соблюдать осторожность, так как циклогексимид ингибирует зигомицеты. Он также может частично ингибировать некоторые виды Aspergillus. и род Candida, участвующих в микотических абортах. По этой причине для культивирования грибковых агентов из микотических абортов рекомендуется SDA только с хлорамфениколом. Кроме того, зигомицеты могут с трудом культивироваться, так как они не остаются жизнеспособными в ткани в течение длительных периодов времени. Неспособность выращивать эти грибы при прямом микроскопическом наблюдении или гистопатологии может быть связана с токсическим эффектом аутолиза плаценты или плода.¹¹ Агаровые чашки инкубируют при 25– 30 °C в течение нескольких недель до морфологической идентификации.

После изоляции и достижении полного роста классические грибки идентифицируют на основе колониальной и микроскопической морфологии (рис. 63.2). Определение этими методами видов нитчатых грибов может быть проблематичным, и могут потребоваться современные молекулярные методы.

Дрожжи обычно идентифицируются на основе ассимиляции углеводов и биохимических исследований с использованием коммерчески доступных тест-систем.¹⁹

Молекулярная детекция специфических генетических последовательностей, полученных методами полимеразной цепной реакции (ПЦР), все чаще используется в микологических референтных (экспертных) лабораториях для идентификации грибов. Эти методы могут применяться к свежим тканям, фиксированным тканям, предназначенным для гистопатологии, или культуральным изолятам.¹³ Идентификация видов грибов с использованием уникальных генетических последовательностей может значительно сэкономить время и обеспечить беспрецедентную специфичность (определение истинно отрицательных образцов) . Тем не менее, из-за повсеместного распространения грибков в окружающей среде и чрезвычайной чувствительности молекулярных методов, результаты должны анализироваться в сочетании с результатами других тестов для постановки правильного окончательного диагноза.

Профилактика и контроль

Поскольку микотические аборты происходят спорадически и провоцируются вездесущими грибками окружающей среды, которые не являются заразными, лучшим средством борьбы является профилактика. Избегание появления заплесневелого сена и фуража, а также некачественного силоса может снизить вероятность возникновения грибкового аборта. Также следует недопускать возникновение затемненной и влажной среды с высоким содержанием органических компонентов, способствующих росту грибов. Снижение грибковой нагрузки на окружающую среду путем обеспечения адекватной вентиляции, предотвращения содержания животных в закрытых помещениях и снижения их плотности может способствовать предотвращению грибковых абортов. Терапия должна быть направлена на предотвращение поражения матки из-за задержания плаценты и связанных с ним вторичных инфекций.

Ссылки

1. James TY, Kauff F, Schoch CL и др. Реконструкция ранней эволюции грибов на основе филогении по шести генам. Nature 2006; 443:818–822.

2. Hibbett DS, Binder M, Bischoff JF и др. Филогенетическая классификация грибов на уровне высших таксонов. Mycol Res 2007;111:509–547.

3. Mycology Online, Школа молекулярных и биомедицинских наук, Аделаидский университет, Австралия. Доступно по адресу http://www. mycology.adelaide.edu.au/, дата обращения: декабрь 2012 г.

4. Guarro J, Gene J, Stchigel A. Развитие таксономии грибов. Clin Micobiol Rev 1999;12:454–500.

5. Kirkbride C. Возбудители, выявленные в ходе 10-летнего исследования абортов и мертворождений у крупного рогатого скота. J Vet Diagn Invest 1992;4: 175–180.

6. Williams B, Shreeve B, Hergert C, Swire P. Микотические аборты у крупного рогатого скота: эпидемиологические аспекты. Vet Rec 1977;100:382–385.

7. Knudtson WU, Kirkbride CA. Грибы, связанные с абортами у крупного рогатого скота в штатах северных равнин США. J Vet Diagn Invest 1992;4:181–185.

8. Kennedy P, Miller R. Женская половая система. В кн.: Jubb K, Kennedy P, Palmer N (ред.) Патология домашних животных , 4-е изд., т. 3. Сан-Диего, Калифорния: Academic Press, 1993, с. 420–421.

9. Hill M, Whiteman C, Benjamin M и др. Патогенез экспериментального микотического плацентита у крупного рогатого скота, вызванного Aspergillus fumigatus . Vet Pathol 1971;8:190–193.

10. Glover A, Rech R, Howerth E. Патология на практике. Микотический аборт. J Am Vet Med Assoc 2011;239:319–321.

11. Carter M, Cordes D, Di Menna M, Hunter R. Грибы, выделенные при микотических абортах и пневмонии у крупного рогатого скота, с особым вниманием к Mortierella wolfii. Res Vet Sci 1973;14:201–206.