Контр. группа ТС группа
y = –0.7961 x + 38.199 y = –1.4688 x + 35.326
R 2 = 0.2192 ( P > 0.05) R 2 = 0.5689 ( P < 0.001)
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5 КГ ТС КГ ТС
0
–21 –14 –7 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133
Дни по отношению к началу теплового стресса (HS)
(%)Бластоцисты
32/32
100
36/41 34/38
80
60 21/38
40
20
0
Зима Лето Зима Лето
Лактирующие коровы Нелактирующ.коровыТелки
(%)Уровень оплодотворения
Рисунок 64.3 Сезонные изменения в уровне оплодотворяемости у голштинов в Висконсине. Репродуктивный тракт осемененных самок был промыт через 5 дней после овуляции для извлечения яйцеклеток и эмбрионов. Коэффициент оплодотворения основывался на количестве извлеченных эмбрионов (двухклеточных или более), деленном на количество извлеченных ооцитов и эмбрионов (см. Цифры над каждым столбцом). Для лактирующих коров летом наблюдалось снижение уровня оплодотворения по сравнению с зимним периодом. Для нелактирующих животных, однако, не было различий в % оплодотворения между сезонами (сравните нелактирующих коров зимой с телками летом). Данные взяты из Sartori R, Sartor-Bergfelt R, Mertens S, Guenther J, Parrish J, Wiltbank M. Fertilization and early embryonic development in heifers and lactating cows in summer and lactating and dry cows in winter. J Dairy Sci 2002;85:2803–2812.
Провал в оплодотворяемости: яйцеклетка в сравнении со спермой
Как показано на рисунке 64.3, существуют различия в уровне оплодотворяемости среди лактирующих коров летом и зимой.45
Снижение процента оплодотворения, вероятно, в значительной степени вызвано повреждением яйцеклетки. Другая важная для оплодотворения клетка - сперматозоид, гораздо более устойчива к повышенной температуре. Тепловой стресс может нарушить образование сперматозоидов в яичке46 , но функция сперматозоидов, депонированных в женском репродуктивном тракте, вероятно, не нарушается гипертермией матери. Тепловой шок не снижал оплодотворяющую способность спермы in vitro или последующее развитие эмбрионов до стадии бластоцисты.47,48 Имеются сообщения о том, что у кроликов воздействие повышенной температуры на сперму in vitro49 или in vivo50 может привести к отклонениям в развитии, что приведет к сокращению числа имплантированных эмбрионов, несмотря на отсутствие снижения оплодотворяемости в целом. Необходима дополнительная работа, чтобы определить, может ли повреждение сперматозоидов тепловым шоком привести к нарушениям развития у плода крупного рогатого скота на более позднем этапе развития.
Повреждение предимплантационного эмбриона
В начале формирования предимплантационный эмбрион очень чувствителен к повышенной температуре. Тепловой шок до 40°C в течение 12 часов может снизить развитие эмбрионов на стадии от зиготы до стадии бластоцисты.51 Тепловой шок также может снизить потенциал развития эмбрионов на 2-клеточной стадии развития,7,52, но после этого эмбрион становится более устойчивым к тепловому шоку. Развитие 4-8клеточных эмбрионов может быть нарушено тепловым шоком, но в меньшей степени, чем у 2-клеточных эмбрионов.52 На стадии развития морулы эмбрион достаточно устойчив к воздействию теплового шока.7,8,51,52 Такое же явление наблюдается in vivo. Воздействие теплового стресса на суперовулировавших коров снижает выход бластоцист на 8-й день после эструса, если воздействие происходит на 1-й день после эструса, но выход не снижается, если воздействие происходит на 3, 5 или 7-й день после эструса.4
Механизм эмбриональной смертности, вызванной тепловым стрессом
Двухклеточный эмбрион, подвергшийся воздействию температуры 41°C, испытывает изменения в ультраструктуре, характеризующиеся набуханием митохондрий и движением органелл по направлению к центру бластомера (клетки эмбриона на этапе дробления)53 (рис. 64.4).
(a) (b)
(c) (d)
Движение органелл вызвано нарушением цитоскелета.54 Ранний эмбрион, подвергшийся тепловому шоку, также испытывает снижение синтеза белка.5
Некоторые повреждения, вызванные тепловым шоком, могут быть результатом увеличения выработки свободных радикалов, что наблюдалось у эмбрионов в 0 и 2 дни после осеменения.55 Кроме того, эффекты теплового шока были сильнее у 2-клеточных эмбрионов, культивированных в атмосфере с высоким содержанием кислорода, что могло способствовать окислительному стрессу.56 В других исследованиях напротив эффекты теплового шока не зависели от напряженности кислорода (парциальное давление кислорода в плазме) .51, 57 Точно так же антиоксиданты антоцианин58 и дитиотреитол56 , как сообщалось, смягчают действия теплового шока, тогда как другие антиоксиданты, включая витамин Е,59 глутатион,60 и эфир глутатиона60 , не обладают эмбриопротекторными свойствами.
Воздействие теплового стресса на выживание эмбриона in vivo может включать воздействие на репродуктивный тракт, а также непосредственно на эмбрион. Тепловой стресс может уменьшить величину преовуляторного всплеска эстрадиола-17β23 , и это предположительно может изменить функцию яйцеводов или эндометрия. Прямое влияние теплового шока на функцию яйцеводов или эндометрия не изучалось при температурах, характерных для тех, которые испытывали коровы, подвергшиеся тепловой нагрузке. Однако вполне вероятно, что эти ткани устойчивы к тепловому шоку, потому что даже температура до 43°C не оказала существенного влияния на синтез белка эндометрием или яйцеводом.61
Эволюционно приобретенная термотолерантность
Существует несколько гипотез, объясняющих процесс, посредством которого эмбрион переходит из состояния сильной восприимчивости к тепловому шоку на стадии от 1 клетки к 2 клеткам, к состоянию, когда он приобрел устойчивость к тепловому шоку на 16-клеточной стадии. Одна из гипотез заключается в том, что ранний эмбрион очень восприимчив к тепловому шоку, потому что процессы, необходимые для активации эмбрионального генома, легко нарушаются тепловым шоком. Если это так, то развитие эмбрионов, подвергшихся тепловому шоку на 2- или 4- клеточной стадии, должно блокироваться между 8-клеточной и 16клеточной стадиями; активация эмбрионального генома необходима для развития после этой стадии.62 Такой преференциальный (предпочтительный) блок при переходе от 8 клеток к 16 клеткам наблюдался в одном эксперименте с 2-клеточными эмбрионами57 , но не наблюдался в другом, где эмбрионы подвергались тепловому шоку на стадии 1 клетки.51
Другая гипотеза состоит в том, что приобретение способности к транскрипции после стадии от 8 до 16 клеток позволяет эмбриону задействовать более широкий диапазон стрессовых реакций для стабилизации клеточной функции во время теплового шока. Однако, на стабильной стадии количество мРНК для некоторых важных стрессовых белков выше у 1-клеточного или 2-клеточного эмбриона, чем у морулы51,62 (рис. 64.5), возможно, потому, что транскрипты наследуются от ооцита.
Стадия P <0.02
2.0 Стадия P <0.001
Температура, P <0.02 Стадия P <0.05
стадия x
температура, P =0.10
1.5
1.0
0.5
0.0
День 0 День 5 День 0 День 5 День 0 День 5 День 0 День 5
HSPA1A HSP90AA1 SOD1 CAT
Кратность изменения показателя
Рисунок 64.5 Различия в устойчивых уровнях мРНК для HSPA1A (белок теплового шока 70), HSP90AA1 (белок теплового шока 90), SOD1 (супероксиддисмутаза) и CAT (каталаза) между эмбрионами, собранными в стадии зиготы (день 0) или морулы (день 5) и культивированными в течение 24 часов при 38,5°C (белые столбцы) или 40°C (черные столбцы) . Данные воспроизводятся из Sakatani M, Alvarez N, Takahashi M, Hansen P. Consequences of physiological heat shock beginning at the zygote stage on embryonic development and expression of stress response genes in cattle. J Dairy Sci 2012;95:3080–3091 с разрешения .
Тепловой шок может вызвать синтез белка теплового шока 70 уже на стадии 2 клеток.5,63 Более того, на стадии морулы транскрипционный ответ эмбриона на тепловой шок приглушен, причем только 4 из 68 генов, связанных с ответным реакцией на тепловой шок, показывают увеличение ответа на повышенную температуру.64 Таким образом, возможно, что повреждение клеточных макромолекул, вызванное тепловым шоком, который провоцирует стрессовые белковые ответы, уменьшается у эмбрионов на устойчивых стадиях развития. Одной из причин может быть изменение баланса между образованием свободных радикалов и антиоксидантной защитой. Тепловой шок вызвал увеличение продукции свободных радикалов в 0 и 2 дни, но не в дни 4 и 6.55 Кроме того, цитоплазматический антиоксидант глутатион находится на самом низком уровне на стадиях от 2 до 8 клеток.65 Одним из механизмов, защищающих эмбрионы от теплового шока, является способность к апоптозу. Проапоптотические сигналы могут активировать ответ на апоптоз только после активации эмбрионального генома; у 2-клеточных эмбрионов этот процесс ингибируется из-за устойчивости митохондрий к деполяризации66 и недоступности каспазо-активированной дезоксирибонуклеазы в межнуклеосомных областях ДНК.67 Воздействие на морулу 41°C в течение 9 часов приводит к апоптозу примерно 10–25% клеток.68,69 Предотвращение апоптоза усугубляет вредное воздействие теплового шока на развитие68,69 , вероятно, потому что апоптоз устраняет клетки, которые наиболее сильно пострадали от теплового шока.
Генетические различия эмбриональной резистентности к тепловому шоку
Определенные породы крупного рогатого скота, выведенные в жарком климате, приобрели гены, защищающие эмбрионы от повышенной температуры. На более поздних стадиях расщепления (4 или 5 день после осеменения) эмбрионы Брахмана, Нелоре и Ромосинуано более устойчивы к повышенной температуре, чем эмбрионы Ангусской, Голштинской или Джерсейской пород.8,70–73 Также обнаружена тенденция к снижению коэффициента стельности после пересадки реципиентам бластоцист Ангуса, которые ранее подвергались тепловому шоку, чего не наблюдалось после пересадки эмбрионов Нелоре, также предварительно подвергавшихся тепловому шоку.73
Факторы, ответственные за породные различия в термотолерантности, по-видимому, наследуются через ооцит. В экспериментах, в которых кроссбредные эмбрионы были получены in vitro, именно порода донора ооцитов, а не порода донора сперматозоидов определяла, проявляют ли эмбрионы повышенную термостойкость.72,74 Одна из теорий состоит в том, что гены, обеспечивающие термотолерантность, импринтированы, причем экспрессируется только женский аллель. По альтернативной версии транскрипты, которые накапливаются в ооците, на более поздней стадии развития становятся ответственны за термотолерантность. Ооцит и вновь образовавшийся эмбрион имеют более высокую степень транскрипции для специфических генов ответа на стресс, чем эмбрионы на 5-й день развития.51,62 Кроме того, ооциты, собранные в теплое время года, более устойчивы к тепловому шоку, примененному in vitro, чем ооциты, собранные в холодное время года.75 Соответственно, характеристики транскриптов, накопленных в ооците во время развития фолликула, могут быть важным фактором, определяющим последующую устойчивость к тепловому шоку.
Важным оставшимся без ответа вопросом является то, существуют ли породные различия в устойчивости ооцитов или ранних эмбрионов к тепловому шоку. Блокирование транскрипции в этих клетках может не позволить проявить генетические различия в термотолерантности. Если это так, генотип, скорее всего, не будет иметь большого значения in vivo, поскольку именно ооцит и очень ранний эмбрион наиболее подвержены повышенной температуре.
Последствия теплового стресса на более поздних сроках стельности
Хотя многочисленные данные указывают на то, что эмбрионы становятся в значительной степени устойчивыми к тепловому стрессу на стадии развития морулы, тепловой стресс может нарушить некоторые аспекты беременности на более поздних гестационных сроках. Получены противоречивые результаты относительно того, влияет ли тепловая нагрузка на позднюю потерю эмбриона и плода. Контролируемый эксперимент для проверки этой гипотезы не проводился. Эпидемиологический анализ (анализ уровня, структуры и динамики заболеваемости за какой-либо период времени или на данный момент) показал связь между жаркой погодой и увеличением потерь стельности между 35–45 и 90 днями стельности у коров в Испании.76
