Воспроизводство крупного рогатого скота

Однако, согласно данным крупномасштабного исследования, частота сохранения беременности между 90 и 150 днями гестации была одинаковой как для свежих, так и для замороженных IVPэмбрионов (43,5%).¹²⁹

Возникновение ранней смертности плода происходит еще чаще после переноса клонированных (NT и SCNT) эмбрионов. Потери от 50 до 100% беременностей при использовании клонированных эмбрионов могут происходить между 30 и 60 днями гестации, по сравнению с 2-10% потерей беременностей, полученных естественным путем, которые обычно происходят в этот период.^15, 20, 62, 130 Второй период высокого уровня потерь наступает во втором триместре беременности в случае клонированных эмбрионов.^15,62,131 Во многих из этих случаев у абортированных плодов отмечают мало грубых аномалий, в то время как плаценты часто имеют серьезные аномалии.^15,62,131 Клонированные беременности также могут подвергаться большим потерям в течение третьего триместра, часто характеризующимся плацентарными аномалиями, включая гидраллантоис, сокращенное количество плацентом и отек плацентарных оболочек.^15,62 Согласно результатам общенационального исследования выживаемости эмбрионов и телят, полученных с помощью SCNT с 1998 по 2007 г., проведенного в Японии, выживаемость SCNT-эмбрионов и телят не улучшилась за этот 10-летний период.¹³² Уровень подтвержденных стельностей на 30-й день после переноса эмбрионов SCNT варьировался от 21,6% до 32,9% и был ниже по сравнению с уровнем стельностей после переноса эмбрионов, полученных in vivo (50–52%) и эмбрионов IVP (37–46%).¹³²

Помимо увеличения частоты внутриутробной смертности, плоды, полученные из эмбрионов IVP и SCNT, демонстрируют множество морфологических аномалий на ранних сроках беременности. По сравнению с контрольной группой ИО, у плодов SCNT и IVP на 80-й день беременности была увеличена масса тела, масса печени и окружность грудной клетки.¹³³ Более того, эти исследователи обнаружили, что отношение копчико-теменной длины темени к окружности грудной клетки является определяющей морфологической характеристикой фенотипа непропорционального чрезмерного роста плода. У клонированных плодов уменьшение копчико-теменной длины и/или сердцебиение плода были предиктивными ультразвуковыми маркерами гибели плода, которая произошла примерно у 27% клонов, умерших до 90 дня беременности.⁴⁹ Эти исследователи отметили, что на основе ультразвуковых исследований после 100-го дня беременности факторы риска потери плодов, полученных из SCNT, включали отек плаценты, водянку и увеличение окружности живота.

Частота врожденных пороков развития, включая гидраллантоис и аномалии конечностей, повышена у телят от эмбрионов IVP (3,2%) по сравнению с контрольной группой ИО (0,7%).¹²⁹ На 90-й день гестации IVP-беременности были связаны с увеличением копчико-теменной длины плода и веса органов по сравнению с контролем in vivo.¹³⁴ На 180-й день гестации IVP-беременность была связана с бо'льшим весом матки, плаценты и плода по сравнению с контролем in vivo. Вес плода, его печени, сердца и вес плацентомы - все коррелировали и были значительно выше при IVP-беременностях.¹³⁴ На 222-й день гестации плоды от IVP-эмбрионов были на 17% крупнее, чем в контрольной группе, произведенной в естественных условиях, и демонстрировали значительное увеличение массы тела плода, размера сердца, веса сердца и длины длинных костей.⁴⁵ Кроме того, у плодов из IVPэмбрионов не наблюдалось разницы в общей массе висцеральных органов, но показатели скелетных мышц на килограмм массы тела были меньше по сравнению с плодами из группы in vivo, что позволяет предположить, что развитие плодов IVP непропорционально их массе тела.

Гистологически плоды IVP на 222-й день гестации демонстрировали значительно большее соотношение числа вторичных и первичных волокон скелетных мышц, чем в контрольной in vivo группе. Также пропорциональный объем ткани, присутствующей между миофибриллами, был больше в мышцах IVP-плодов по сравнению с контролем.¹³⁵ Экспрессия мРНК миостатина была снижена в скелетных мышцах плодов из группы IVP, в то время как экспрессия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) имела тенденцию к увеличению по сравнению с группой, полученной in vivo. Эти наблюдения согласуются с наблюдаемыми изменениями в соотношении мышечных волокон, поскольку миостатин является ингибитором развития мышечных волокон, а GAPDH является ключевым ферментом в гликолизе - пути, который активно используется вторичными мышечными волокнами.¹³⁵

Показатели перинатальной смертности 8,6–15,6% среди IVP- телят при рождении или вскоре после рождения были зарегистрированы у телок-реципиентов и достигали 17,9% у коров-реципиентов.^7,54,129 Напротив, уровень перинатальной смертности телят от ИО составлял приблизительно 6,2–9,0% для беременностей с переносом эмбрионов in vivo.^22,129 В одних исследованиях сообщалось об увеличении срока беременности для IVP-плодов¹²⁹ , в то время как в других - нет.⁴⁴ Частота мертворождений и перинатальной смертности в течение первых 48 часов после отела была увеличена у IVP-телят по сравнению с контрольной группой, полученной in vivo, но не из-за изменения продолжительности беременности.¹³⁶ Мертворождение и послеродовая смертность также увеличивались при беременностях с SCNT. Только около 70% клонированных плодов крс выживают в перинатальном периоде, и эти потери, как правило, распространяются на первую неделю постнатальной жизни (см. ссылку 48). По данным национального опроса 2012 года, проведенного Министерством сельского хозяйства Японии, из 594 клонированных телят, родившихся в Японии в период с 1998 по 2007 год, 14,8% были мертворожденными, а 95% умерли в течение 24 часов после родов.¹³⁷ Частота отелов при SCNT-беременностях (5,1–12,6%) также была ниже, чем при переносе эмбрионов in vivo (23,9–34,8%) и IVP (20,2–22,3%).¹³² По данным 5- летней практики коммерческого клонирования в США, Аргентине и Бразилии,⁴⁹ из 3374 перенесенных эмбрионов SCNT, 41% были живы на 30-й день беременности, но только 9% от общего числа перенесенных эмбрионов привели к живорождению. Из этих 388 живых SCNT-телят около 42% умерли в период между родами и 150 днем жизни.⁴⁹ Эффективность клеточных линий для успешного получения жизнеспособных беременностей SCNT варьировалась от 0 до 45%, при этом около 24% клеточных линий не давали живых телят.⁴⁹

Наиболее заметными аномалиями, наблюдаемыми в перинатальном периоде после переноса эмбрионов IVP, являются появление телят с большой массой тела при рождении в сочетании с более широким распределением показателей массы тела при рождении по сравнению с контрольной группой in vivo. Высокий уровень перинатальных потерь, ассоциированный с IVP-беременностью, в значительной степени может быть связан с дистоцией, возникающей в результате крупноплодия.^44,59 Дистоция может иметь долгосрочные последствия для здоровья, продуктивности и будущей репродуктивной способности животных-реципиентов.⁵⁹ Высокий вес при рождении, связанный с пересадкой IVP-эмбрионов был зарегистрирован среди нескольких пород Bos taurus, включая голштинскую, ангусскую, симментальскую и японскую черную.^{55,129,136,138,139} Перенос IVP-продуцированных эмбрионов у индийского крупного рогатого скота породы Гир также привел к более высокому весу при рождении, чем в контрольной группе от ИО, особенно выраженном среди бычков.¹⁴⁰ Интересно, что IVP-телята показали не только более высокий вес при рождении, но и повышенные концентрации фруктозы в плазме после рождения по сравнению с контрольной группой in vivo.¹³⁴ Эти факторы, повидимому, связаны с метаболическим расстройством у IVP-телят.

Общие морфологические аномалии, о которых сообщалось после переноса эмбрионов SCNT, включали увеличенную пуповину, респираторные проблемы, длительное лежачее положение и контрактуру сухожилий сгибателей.⁴⁹ Кроме того, клонированные телята демонстрировали другие аномалии при рождении, включающие гипотермию, гипогликемию, тяжелый метаболический ацидоз и гипоксию, хотя эти параметры не имели достоверной корреляции с массой тела при рождении. Поскольку концентрации инсулина в плазме были значительно повышены, а концентрация глюкагона в плазме коррелировала с массой тела при рождении, аберрантная доступность энергии и ее использование в утробе матери могут вызывать состояния, аналогичные тем, которые наблюдаются при гестационном диабете у человека.¹⁴¹ При рождении у клонированных телят часто наблюдается респираторный дистресс-синдром¹⁴² , а в некоторых случаях наблюдается левосторонняя кардиопатия с расширением желудочков и легочной гипертензией.¹⁴² Кроме того, при рождении телят, которые выглядели аномальными, также наблюдался отек плаценты.¹⁴² В других исследованиях сообщалось об увеличении пупочных сосудов и различной степени отека, а также о таких заболеваниях, как руменит, абомазит и кокцидиоз при рождении.^{15,20,52,64,143} Среднее количество плацентом также было ниже, а средний вес плацентом выше в плаценте клонированных телят по сравнению с контрольной группой IVP.⁵²

Плоды и телята от эмбрионов IVP или SCNT демонстрируют правостороннее распределение веса по сравнению с ИО или in vivo полученными контролями.^52,54,55,144 Клонированные телята при рождении были на 20% крупнее по сравнению с телятами, полученными в результате переноса in vivo эмбрионов или ИО-телят, и имели более значительные различия в весе при рождении.³³ Интересно, что клонированные телята, полученные из ооцитов, созревших in vitro, имели значительно более высокий вес при рождении, чем клонированные телята, полученные из ооцитов, созревших in vivo. Фактически, средний вес при рождении телят-самок, полученных in vitro, был значительно выше, чем у in vivo полученных телят-самцов.⁷⁹ Сообщалось, что доля потомства мужского пола, полученного в результате переноса эмбрионов IVP, увеличилась по сравнению с ожидаемым соотношением 1:1 по сравнению с контрольной группой ИО, где сохранялось нормальное соотношение полов.^104,129,140 Напротив, в других исследованиях не сообщалось о различиях в доле самцов, рожденных после переноса эмбрионов IVP.^45,54,145

Плоды, полученные из IVP-эмбрионов, также могут отличаться по экспрессии генов и белков по сравнению с плодами, полученными in vivo. На 90-й день гестации IVP-беременности были связаны с более низкими концентрациями глюкозы у плода, чем в контроле in vivo.¹²⁸ Экспрессия мРНК IGF2 была вдвое выше в ткани печени на 63-й день, но уменьшилась в ткани скелетных мышц плодов, полученных из эмбрионов IVP, по сравнению с таковой в контрольной группе, полученной in vivo.¹⁴⁶ Кроме того, скелетная мышечная ткань IVPплодов на 222-й день гестации имела более низкую экспрессию мРНК миостатина и имела тенденцию к повышению экспрессии мРНК GAPDH по сравнению с контролем in vivo.¹⁴⁷ Напротив, несмотря на различия в морфологии плода и плаценты на 90-й или 180-й день гестации между беременностями, полученными переносом IVP- или in vivo-эмбрионов, не было обнаружено значительных различий в уровнях экспрессии мРНК в печени плодов и тканях плаценты при этих беременностях, когда для анализа использовалось 13000 олигонуклеотидных микрочипов.¹⁴⁸ Поскольку эти результаты противоречили данным более ранних исследований, Jiang и др.¹⁴⁸ предположили, что аномальная экспрессия генов может быть специфичной для стадии развития и ткани. С другой стороны, ограниченное количество наблюдений, используемых в каждой подгруппе обработка/стадия в сочетании с ограниченным размером массива экспрессии могло препятствовать идентификации различий в экспрессии мРНК.

Развитие плаценты

Помимо аномалий плода, получение телят путем переноса эмбрионов IVP или SCNT связано с дефектами развития плаценты и кровообращения. Плаценты при беременностях IVP или SCNT плодами могут отличаться морфологией, функцией, экспрессией генов, выработкой гормонов или белка по сравнению с плацентами при пересадке in vivo эмбрионов или беременности от ИО.^{15,51,52,59,62,149} Нарушения плацентации и функции плаценты могут повлиять на рост и развитие этих плодов, полученных с помощью методов in vitro. Аномалии развития плаценты еще более выражены при беременности с эмбрионами SCNT; фактически, большинство случаев невынашивания беременности при SCNT связано с плацентарной недостаточностью.^62, 142 Напротив, при нормальных беременностях (полученных in vivo) большая часть потерь происходит из-за аномалий развития плода.⁵⁴

Потеря IVP-беременностей на ранних сроках может быть связана с аномалиями и сбоями в развитии плаценты. Общие морфологические аномалии, зафиксированные в плаценте IVP, включают увеличение размера (плацентомегалия), увеличение объема плацентарной жидкости (гидроллантоис) и уменьшение площади поверхности плацентом (см. Ссылку 59). При анализе плаценты на 70-й день беременности от эмбрионов, полученных in vitro с использованием либо полуопределенной ( полусинтетической) культуральной среды (mSOF), либо неопределенной (натуральной) среды с добавлением сыворотки (M199), и в сравнении с in vivo продуцированными контролями, 51 из плацент от эмбрионов, полученных в среде mSOF, были тяжелее, имели пониженную производительность, меньшее количество плацентом и меньшее количество плацентарной жидкости по сравнению с таковыми в группе М199 или с контрольными группами in vivo. Кроме того, плаценты из группы mSOF имели пониженную плотность кровеносных сосудов и уровни мРНК фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в котиледонах, что свидетельствует о нарушении развития сосудов. Кроме того, наблюдалась повышенная плотность пикнотических клеток (клетки со сморщенным ядром из-за потери воды) плода в плацентомах из группы mSOF по сравнению с контрольными группами M199 и in vivo, что указывает на повышенную гибель клеток в ворсинах плода.⁵¹ Другие аномалии плаценты, которые наблюдались при беременностях с IVP на ранних сроках, включают различия в распределении размеров плацентом, их весе и площади поверхности на 90-й и 180-й дни гестации.^128,134 Более того, плацентомы, непосредственно окружающие плод, были длиннее и тоньше в течение первого триместра IVP-беременностей по сравнению с контрольной группой. На 180-й день беременности увеличение площади поверхности плацентом и их веса было связано с повышенным накоплением глюкозы и фруктозы в плазме и жидкостях плода.¹³⁴ Несмотря на то, что плаценты у IVP-беременных коров имели значительно меньшее количество котиледонов, чем плаценты от контрольных животных in vivo, они имели большую площадь поверхности котиледонов. Была выдвинута гипотеза, что повышенное использование питательных веществ у более крупных IVP-плодов может быть ответственным за более высокий вес плода, наблюдаемый в этой экспериментальной группе.^{128, 134}

Плаценты первого триместра у беременных с SCNT-плодами могут не иметь надлежащей васкуляризации и демонстрировать аномалии, включая гипоплазию и отставание котиледонарного развития.^62,150–153

Точно так же потеря SCNT-беременности на более поздних сроках была связана с рядом факторов, включая уменьшение числа котиледонов или плацентом, гидроллантоис, отек плаценты и анасарку плода.¹⁵ Неправильное развитие аллантоиса часто является основной причиной гибели эмбрионов после 30 дня беременности, поскольку аллантоис необходим для формирования хориоаллантоисной плаценты. Плацентомы начинают формироваться примерно с 30 дня.¹⁵⁴ Эмбрионы SCNT могут иметь нарушенное формирование котиледонов или другие проблемы, которые препятствуют правильному развитию структуры и количества плацентом.¹⁵⁰ Количество плацентом более вариабельно при беременностях с SCNT по сравнению с контрольной группой ИО^62,150 , и существует высокая вероятность выкидыша к 90-му дню беременности, если количество плацентом очень низкое.^59,62,150

На более поздних сроках беременности плаценты при IVP- или SCNTбеременностях могут иметь другие морфологические или функциональные аномалии. На 222-й день гестации плаценты, полученные от беременных IVP-плодами, имели увеличенный пропорциональный объем кровеносных сосудов в материнских карункулах по сравнению с контролем in vivo.⁵⁰ Кроме того, плаценты из группы IVP имели повышенное соотношение объема ткани, занимаемого кровеносными сосудами, к площади поверхности плацентом, что указывает на потенциально повышенную васкуляризацию по сравнению с контролем. Напротив, не было выявлено различий в объемной плотности ворсинок плода на 70-й день между группами IVP и in vivo, что позволяет предположить, что нарушения в формировании ворсинок, вероятно, возникают на более поздних сроках беременности.⁵¹ Точно так же не было разницы в массе плаценты на 70-й день беременности, тогда как на 222-й день плаценты от IVP-плодов были тяжелее, чем контрольные in vivo.⁵⁰ Эти результаты также подтверждают предположение о том, что отклонения в росте плаценты, связанные с IVP-беременностью, происходят на более поздних сроках.⁵¹ Избыточный рост плода, связанный с in vitroпроцедурой его получения, вероятно, приводит к повышенной потребности в питательных веществах и газообмене, а плаценты от IVPбеременных могут развивать компенсаторные механизмы в сосудистой системе для решения проблемы уменьшенной площади поверхности, доступной для контакта плода и матери.⁵⁰ Заболеваемость гидраллантоисом среди IVP-беременных составляет примерно 1 из 200 беременностей, что значительно выше, чем 1 из 7500 случаев, зарегистрированных при нормальной беременности.⁵⁴

Во второй половине гестации в SCNT-плаценте могут наблюдаться плацентомегалия и гидраллантоис, при этом отек плода и тканей плаценты является основной причиной гибели плода при беременности с SCNT.¹⁵⁰ Кроме того, диаметр пуповины, как правило, больше, а ее просвет увеличен из-за отсутствия складок в просвете при SCNTбеременностях по сравнению с контрольными беременностями ИО.^150,151 Избыточный рост плаценты при SCNT-беременностях может быть вызван врожденными дефектами плаценты, а не чрезмерным ростом плода, и может охватывать до 50% поздне-гестационных SCNTбеременностей.¹⁵¹ Разрастание плаценты происходило до избыточного роста плода, и соотношение веса плода к весу плацентом было ниже при беременностях с SCNT по сравнению с контрольной группой ИО и in vitro.¹⁵¹

Плаценты от беременностей IVP или SCNT демонстрируют различия в экспрессии генов или продукции белка. Например, карункулярные уровни PPARγ - транскрипционного фактора, участвующего в экспрессии VEGF и развитии сосудов, - были увеличены на 222-й день у плацент при IVP-беременности по сравнению с контролем in vivo.⁵⁰ Различия в экспрессии генов плацентом между беременностями в группах SCNT, IVP и ИО, взятых между 174-м днем беременности и доношенным сроком, оценивались с помощью микрочипового анализа.¹⁴⁹

В общей сложности между плацентомами IVP и SCNT были идентифицированы 162 дифференциально экспрессируемых гена (DEG), а между плацентомами ИО и SCNT были идентифицированы 276 DEG.¹⁴⁹ Некоторые DEG были общими для плацентомов IVP и SCNT, что свидетельствует о влиянии системы культивирования на транскриптом плацентома. Плаценты SCNT имели сильно измененные уровни экспрессии генов, независимо от наличия нормальной или аномальной морфологии. Более того, авторы исследования предположили, что неспособность компенсировать плацентарную дисфункцию приводит к гибели плода и другим аномалиям, связанным с АОS.¹⁴⁹ Это также согласуется с предположением о том, что голодание плода из-за плацентарной недостаточности может быть основной причиной потери SCNT-беременностей после 50го дня.⁶² Весьма вероятно, что недостаточность обмена питательными веществами между плодом и матерью и выведения продуктов обмена является основной причиной потери беременности в интервале от середины до позднего гестационного срока в сочетании с AOS типа III.

Астон и др.¹⁵⁵ использовали массив генома крупного рогатого скота Affymetrix GeneChip для исследования экспрессии генов между SCNT-котиледонами на 70-е сутки и ИО-плацентой и сообщили о 19 DEGs между группами. Однако, ни один из их DEG не совпадал с таковыми в исследовании Everts и др.¹⁴⁹ Вероятно, это связано с взятием образцов разных тканей в разные моменты времени. Недавно тот же самый Affymetrix GeneChip был использован для исследования глобального транскриптома плаценты на 50-й день, полученной при беременностях ИО, IVP и SCNT.¹⁵⁶ Всего между плацентами групп SCNT и ИО было идентифицировано 1196 DEG, из которых 9% были вызваны ошибкой транскрипционного репрограммирования.¹⁵⁶ Плаценты из группы IVP имели только 72 DEG по сравнению с группой ИО, причем 58 из этих DEG также были общими для SCNT-плацент. DEG в группах SCNT и IVP участвовали в развитии органов, развитии кровеносных сосудов, организации внеклеточного матрикса и иммунной системы.¹⁵⁶ Интересно, что 96% DEG в группе SCNT не отличались по регуляции от группы IVP, указывая на то, что эти плаценты испытывают уникальное нарушение экспрессии генов. Кроме того, более высокий уровень дисрегуляции транскриптома в плаценте SCNT согласуется с более высокой степенью морфологической дисрегуляции, сообщаемой при беременностях SCNT. Средние концентрации глюкозы в жидкости плода не различались между беременностями SCNT и ИО на ранних сроках; тем не менее, уровни глюкозы в плодной жидкости были ниже при прерывании SCNT-беременности с наличием увеличенной плаценты или уменьшенного количества плацентом.¹⁵⁷ Скорость роста плаценты при SCNT-беременностях не снижалась, как при ИО-беременностях, и есть доказательства того, что экспрессия транспортера глюкозы GLUT3 была повышена в SCNT-плаценте, что указывает на увеличение поглощения глюкозы плацентой при SCNT-беременности.^158,159 Плацента крупного рогатого скота также является основным источником эстрона, а эстрогены, полученные из плаценты, играют роль в проницаемости сосудов и распределении внеклеточной жидкости.¹⁵⁰ Повышенные уровни эстрадиола были зарегистрированы при SCNT-беременности, начиная с 80-го дня, и они могут способствовать часто наблюдаемому отеку плаценты и плода.¹⁵⁰ Нарушенные уровни эстрогена при SCNTбеременности также могут быть причиной недостаточного развития молочных желез, наблюдаемого непосредственно перед отелом, и недостаточной подготовки к родам.¹³¹