Аномально высокие концентрации связанных с беременностью гликопротеинов (PAG) на 50-й день стельности коррелировали с гибелью плода при SCNT-беременности.131 На основании данных, полученных с использованием глобального протеомного подхода (исследование белков) для изучения дифференциальной экспрессии белков в плаценте, взятой либо после отела с SCNT-плодами, закончившегося постнатальной смертью, либо после родов с нормальной беременностью ИО,160 было идентифицировано 60 дифференциально экспрессируемых белков. Эти белки связаны с репарацией (восстановлением) белков, цитоскелетом, передачей сигналов, иммунной системой и метаболизмом.160 Эти исследователи подтвердили аномальные уровни экспрессии нескольких предполагаемых дифференциально экспрессируемых белков, включая TIMP2, в SCNT-плаценте, которые, как известно, играют важную роль в развитии плаценты.
Долгосрочное влияние на жизнеспособность телят
Телята, полученные в результате переноса эмбрионов IVP или SCNT, дожившие до родов, могут по-прежнему демонстрировать ухудшение здоровья. У этих телят могут быть врожденные проблемы, такие как гипоплазия мозжечка, респираторная недостаточность и увеличение сердца.59 Несмотря на различия в массе тела при рождении между телятами, полученными в результате переноса IVP и in vivo эмбрионов, на скорость постнатального роста и массу годовалых телят не влиял источник эмбриона или масса при рождении.33,139
Клонированные телята также могут проявлять аномалии в течение первых нескольких месяцев жизни. Средний объем эритроцитов у клонированных телят был выше при рождении, а в течение первой недели после рождения температура тела и концентрации лептина в плазме были выше, а уровни тироксина ниже у клонированных телят по сравнению с контрольной группой.52 Интересно, что в этом исследовании повышенная температура тела наблюдалась, по крайней мере, до 50 дней после родов. Другие зарегистрированные различия у клонированных телят включают различную длину теломер (концевых участков хромосом) у клонированных телят, связанную с разными типами донорских ядер клеток161 , и более позднее начало полового созревания у клонированных телок по сравнению с контрольными животными от ИО.162 У быков, полученных в результате переноса эмбрионов IVP, которые были слишком крупными при рождении, было зарегистрировано увеличение веса сердца на килограмм веса тела при убое.139 Таким образом, несмотря на то, что они выглядят здоровыми, эти данные свидетельствуют о том, что по крайней мере часть телят, полученных в результате переноса эмбрионов IVP и SCNT, не является физиологически нормальными в течение первых нескольких месяцев жизни.
Хотя АОS наблюдается при большом количестве клонированных беременностей, некоторые особи рожают нормально и после родов не требуют особой ветеринарной помощи. Несмотря на различие в весе при рождении в 24% между телятами, полученными от эмбрионов SCNT и контрольной группы in vivo, ускоренный рост и вариабельность веса не продолжались во время постнатального развития и составляли менее 5% в возрасте 1 года.33 Те клоны, которые доживают до зрелого возраста, по-видимому, имеют нормальную репродуктивную функцию и потомство. Клонированные телки, использованные в программе эмбриотрансфера, имели уровни производства эмбрионов, аналогичные контрольным, а также нормальные показатели воспроизводства и отела.49 Аналогичным образом было обнаружено, что клоны взрослых самцов дают сперму хорошего качества с нормальной фертильностью при ИО. Кроме того, потомство нескольких клонированных взрослых особей в этом исследовании также показало нормальные репродуктивные показатели и молочную продуктивность.49
Ряд исследований практически не выявили различий в скорости роста, продолжительности эстрального цикла, гормональных профилях, включая лютеинизирующий гормон (ЛГ), ФСГ, E2, P4, IGF1 и гормон роста, а также в характеристиках лактации и общей репродуктивной способности клонов по сравнению с неклонированными телятами того же возраста.15,33,52,163 Кроме того, было обнаружено, что производство молока и мяса клонированным рогатым скотом было таким же, как и у крупного рогатого скота, полученного путем ИО.164-166 Таким образом, хотя перенос IVP- или SCNTэмбрионов может быть связан с широким спектром аномалий во время беременности и даже после родов, телята, дожившие до взрослого возраста, могут вести здоровую продуктивную жизнь.
Механизмы, лежащие в основе AOS
Изначально предполагалось, что аномалии, наблюдаемые у эмбрионов, плодов, плаценты и потомства крс, полученного путем переноса эмбрионов IVP или SCNT, являются результатом эпигенетической дисрегуляции и последующей аберрантной экспрессии мРНК важных для развития импринтированных генов.63,105,167,168 Импринтированные гены экспрессируются моноаллельно, в зависимости от того, от какого родителя поступили аллели, в результате эпигенетических модификаций.169 Эпигенетические модификации - это химические изменения ДНК или гистоновых белков, которые изменяют структуру хроматина без изменения нуклеотидной последовательности.170 Эмбрионы, полученные из IVP и SCNT, подвергаются воздействию среды IVC, которая, как считается, нарушает приобретение или поддержание эпигенетических паттернов, регулирующих экспрессию импринтированных генов.115, 171, 172 В дополнение к повреждениям под действием среды IVC, SCNT-эмбрионы также должны преодолеть разрыв зоны, потерю материнской цитоплазмы и цитоскелета, электрическое или химическое слияние и активацию энуклеированного ооцита с донорской клеткой, а также эпигенетическое перепрограммирование донорского ядра в тотипотентное состояние (способность одной клетки делиться и производить все дифференцированные клетки в организме. Полностью дифференцированная клетка может вернуться в состояние тотипотентности, что и происходит при клонировании) .173 Другой источник эпигенетической дисрегуляции, способствующий аномальным фенотипам, связанным с AOS, может возникать в результате аспирации и IVM ( дозревание in vitro) ооцитов крупного рогатого скота перед манипуляциями IVP или SCNT. Приобретение материнских эпигенетических модификаций, которые регулируют экспрессию импринтированных генов, происходит на последних стадиях развития фолликулов, в период, когда кумулюсооцитные комплексы аспирируются и могут также изменяться во время IVM.174 Интересно, что многие импринтированные гены регулируют экспрессию не импринтированных генов. Следовательно, аномальные фенотипы могут возникать из-за аберрантной экспрессии неимпринтированных генов, возникающей вследствие эпигенетической дисрегуляции импринтированных генов.59 Кроме того среда IVC и протоколы SCNT могут оказывать неблагоприятное влияние на модификации ДНК, регулирующие экспрессию неимпринтированных генов, независимо от геномного импринтинга.59 Сложность потенциальных механизмов, лежащих в основе AOS, усугубляется наблюдением, что протоколы IVC и SCNT также негативно влияют на экспрессию генов, которые регулируют приобретение и поддержание эпигенетических модификаций, необходимых для соответствующей экспрессии импринтированных генов.
Эпигенетическая дисрегуляция импринтированных генов
Предполагается, что аномалии, наблюдаемые у эмбрионов, плодов, плаценты и потомства, полученного в результате переноса эмбрионов IVP или SCNT, являются результатом неадекватных условий IVC или неправильного эпигенетического репрограммирования во время процедур SCNT, ведущих к неправильному установлению или поддержанию эпигенетических паттернов, регулирующих экспрессию импринтированного гена в критические периоды доимплантационного развития.59,168,175,176
Многочисленные эксперименты на крупном рогатом скоте и овцах, изучающие аберрантную экспрессию импринтированных генов после переноса эмбрионов IVP или SCNT, подтверждают эту гипотезу.146,172,177– 183 Недавно однонуклеотидные полиморфизмы в модели Bos taurus × Bos indicus были использованы для исследования экспрессии импринтированных генов для концептов in vivo, IVP и SCNT на 17-й
день гестации и для плодов и плаценты на 45-й день.171 Моноаллельная экспрессия исследованных импринтированных генов не поддерживалась в полной мере в исследуемых тканях, а в некоторых случаях релаксация импринтов метилирования ДНК была связана с несоответствующей двуаллельной экспрессией.171 Дополнительные исследования по изучению отпечатков метилирования ДНК, важных для развития импринтированных генов, также подтверждают гипотезу о том, что эпигенетическая дисрегуляция является ключевым фактором, который, вероятно, способствует возникновению аномалий, связанных с AOS.175, 177, 182, 184–186
Дальнейшее подтверждение этой гипотезе было предоставлено исследованиями других известных эпигенетических изменений, таких как ковалентные модификации гистонов.187–193 Предполагается, что модификации гистонов, включая ацетилирование и метилирование, играют роль в регуляции экспрессии импринтированных генов посредством замалчивания РНК ( подавление экспрессии генов)194,195 или активации моноаллельной экспрессии.196
В настоящее время известно более 140 импринтированных генов у мышей и людей.170 Однако, до сих пор исследования на крупном рогатом скоте были сосредоточены только на небольшом подмножестве импринтированных генов. Известно, что доимплантационный эмбрион крупного рогатого скота чувствителен к измененным эпигенетическим модификациям, производимым системой IVC или протоколами SCNT на основе результирующей аберрантной экспрессии импринтированных генов.63,101, 197 Наблюдение за тем, что некоторые импринтированные гены обладают способностью регулировать экспрессию неимпринтированных генов, предполагает, что начальная эпигенетическая дисрегуляция, вызванная IVC и SCNT, может усугубляться этим последующим влиянием на экспрессию неимпринтированных генов.59,198,199
Эпигенетическая дисрегуляция неимпринтированных генов
Среда для IVC (культивирования эмбрионов) и протоколы SCNT могут влиять на экспрессию неимпринтированных генов посредством последующих эффектов аберрантно экспрессируемых импринтированных генов и эпигенетической дисрегуляции самих неимпринтированных генов. В раковых клетках человека аберрантная экспрессия импринтированного гена p73 подавляла экспрессию VEGF - не импринтированного гена, который является важным плацентарным ангиогенным фактором.198,199 Разумно ожидать, что аналогичные эффекты на не импринтированные нижестоящие регуляторы могут также возникать у бычьих эмбрионов и плодов, созданных в таких условиях, как при IVC и SCNT, которые вызывают аберрантную экспрессию импринтированных генов. Альтернативно, аберрантная экспрессия неимпринтированных генов может происходить в результате гиперметилирования на CpG-островках, окружающих промоторы неимпринтированных генов.200 В этом случае такие эпигенетические ошибки не будут зависеть от механизмов импринтинга. Например, в хорионе SCNT-беременных коров промотор эпидермального гена цитокератина и повторяющиеся элементы сателлита-1 были гиперметилированы по сравнению с таковыми у контрольных животных in vivo.59,201 Хотя точные механизмы, которые регулируют экспрессию неимпринтированных генов, остаются неясными, очевидно, что протоколы IVC и SCNT могут отрицательно влиять на экспрессию неимпринтированных генов и, в свою очередь, способствовать аномалиям, связанным с AOS.51,63,135,202–204
Измененная экспрессия мРНК, кодируемых неимпринтированными генами, включая миостатин и GAPDH, была связана с повышенным соотношением типов вторичных мышечных волокон к первичным мышечным волокнам у IVP-плодов.135 Аналогичным образом, измененная экспрессия мРНК или белков VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) , PPARγ (рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами) , лептина, лактогена бычьей плаценты, трансформирующего фактора роста TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3, рецепторов TGFβ (TGFβ - трансформирующий фактора роста бета - белок (представитель цитокинов), который контролирует пролиферацию, клеточную дифференцировку и другие функции в большинстве клеток) и основных антигенов класса I гистосовместимости были обнаружены в плаценте от беременностей IVP или SCNT.50,51,202–204 Эти более тонкие изменения в развитии плода или плаценты после процедур IVP или SCNT, которые не подпадают под классическое определение синдрома «крупноплодия», могут, тем не менее, отражать возникновение эпигенетической дисрегуляции, характерной для AOS.59
Исследование паттернов экспрессии генов у эмбрионов, плодов и плаценты крупного рогатого скота, овец и мышей, полученных с помощью IVC или прошедших процедуры SCNT, продемонстрировало измененную экспрессию импринтированных,63,104,146,177,205 X-сцепленных,63,201,206 и не импринтированных51,63,135,203,204 генов. Изменения в паттернах метилирования эмбрионов и глобальных уровнях метилирования были связаны с изменением доимплантационного развития207,208 и неблагоприятными исходами беременности с SCNT-плодами.209 Эти эффекты могут быть лишь вторичными ответными реакциями, которые являются результатом начального влияния измененного эпигенетического статуса импринтированных генов на ранней стадии доимплантационного или периимплантационного развития. С другой стороны, они могут указывать на то, что IVC и обработка могут влиять на паттерны метилирования, которые могут участвовать в регуляции экспрессии неимпринтированных генов, как это было предложено для других систем200,210 и наблюдалось при беременностях с SCNT.201 Таким образом, вероятно, что гиперметилирование промоторов, содержащих CpG-островки, при SCNT-беременностях может приводить к изменениям в экспрессии генов независимо от импринтинга. В совокупности эти наблюдения подтверждают предположение, что глобальные эпигенетические модификации, влияющие на экспрессию неимпринтированных генов, могут играть важную роль в возникновении AOS.
В исследованиях тканей плаценты человека была признана важность как импринтированных, так и не импринтированных генов в контроле роста плода и функции плаценты. Например, была выявлена взаимосвязь между нарушением регуляции импринтированных генов и возникновением задержки внутриутробного развития у человека, синдрома, который влияет как на функцию плаценты, так и на рост плода.211 Интересно, что в то время как эпигенетическая дисрегуляция у таких видов, как крупный рогатый скот и овцы, приводит к чрезмерному росту плода, аналогичная дисрегуляция приводит к противоположному фенотипу у людей. Эти наблюдения подтверждают необходимость изменения номенклатуры с синдрома «крупноплодия» на более точный и широко применимый термин AOS.59
Нарушение эпигенетических регуляторов
У млекопитающих в период раннего эмбрионального развития паттерны метилирования ДНК, которые регулируют экспрессию генов, приобретаются и поддерживаются семейством ферментов, называемых ДНК-метилтрансферазами (DNMT).168,170,212
У растущего плода появляются примордиальные половые клетки, которые мигрируют к генитальному гребню, претерпевая митотическое деление. В этот период их ДНК подвергается полному деметилированию. DNMT3A, 3B и 3L являются de novo метилтрансферазами, которые функционируют для установления полоспецифичных паттернов метилирования локусов импринтированных генов во время гаметогенеза.168,174,212
Материнские импринты (или отпечатки - специфическая память родительского происхождения хромосом) приобретаются постнатально во время фолликулогенеза, что совпадает с ростом глобального метилирования ДНК, которое достигает своего максимума перед овуляцией в полностью выросших ооцитах, которые задерживаются на стадии диктиата (GV) (или стадии покоя, когда первичные ооциты перестают делиться) .213,214 Напротив, отцовские импринты устанавливаются еще до рождения в половых клетках развивающегося самца.176 В зиготе отцовский геном подвергается активному деметилированию ДНК, которое происходит быстро после оплодотворения.176,212 Для сравнения, деметилирование материнского генома происходит пассивно из-за исключения DNMT1 из ядра во время ранних делений расщепления.176 DNMT1 отвечает за поддержание паттернов метилирования во время репликации ДНК.215 В то время как глобальное деметилирование ДНК происходит в родительских геномах ранней зиготы, следы полоспецифического метилирования сохраняются. Считается, что у мышей материнский и отцовский импринты поддерживаются в зиготе с помощью ооцит-специфической изоформы DNMT1, обозначенной как DNMT1o.216 Однако, у крупного рогатого скота эта изоформа ооцита не была идентифицирована.217,218 У мышей протеин DNMT1 присутствует в фолликулах на ранних стадиях, а затем переходит в цитоплазму на более поздних этапах дифференцировки ооцитов и раннего эмбриогенеза.219,220 Считается, что деметилирование родительского генома происходит в результате исключения DNMT1 из ядра во время ранних делений дробления.175 У крупного рогатого скота новообразованный эмбриональный геном реметилируется по мере перехода к стадии бластоцисты под действием метилтрансфераз de novo DNMT3A, 3B и 3 L.168, 174, 176, 212
У эмбрионов, продуцируемых in vivo, активное деметилирование отцовского генома и пассивное деметилирование материнского генома приводит к гипометилированию в период раннего дробления.175,221 Когда эмбрион достигает стадии бластоцисты, метилирование de novo совпадает с дифференцировкой клеток, участвующих в формировании внутренней клеточной массы и трофэктодермы. Таким образом, устанавливаются тканевые и временно-специфические паттерны метилирования, которые будут передаваться на протяжении всего развития.212,222,223 Поскольку DNMT отвечают за стирание, приобретение и поддержание импринтов метилирования в гаметах, а также за создание и поддержание паттернов метилирования ДНК во время эпигенетического репрограммирования эмбриона, было высказано предположение, что аномалии, связанные с AOS после переноса эмбрионов IVP или SCNT могут быть результатом аномальной экспрессии или функции DNMT.224–226 Измененная экспрессия мРНК DNMT1 и DNMT3a наблюдалась у эмбрионов IVP и SCNT перед имплантацией63 , что еще раз подтверждает гипотезу о том, что нарушение регуляции DNMT приводит к каскаду аберрантной экспрессии импринтированных генов и последующим аномалиям развития.63 Дополнительные нарушения могут возникать из-за изменений структуры хроматина и модификаций гистонов, которые могут способствовать нарушению доступа DNMT к геному во время развития.59
Эмбрионы SCNT крупного рогатого скота демонстрируют гиперметилированную ДНК по сравнению с эмбрионами in vivo - ситуация, которая напоминает статус метилирования соматической донорской клетки.187,224,227,228
У SCNT-эмбрионов крупного рогатого скота деметилирование ДНК не происходит после 2-клеточной стадии.175 Таким образом, некоторые сбои в развитии беременностей с SCNT могут возникать из-за неправильного деметилирования ДНК с последующим поддержанием гиперметилированного состояния клеток линии трофэктодермы, что приводит к аберрантной экспрессии генов и аномалиям плаценты.223,224,229,230 Действительно, экспрессия мРНК DNMT1 и уровни метилирования ДНК были значительно выше на всех предимплантационных этапах у SCNT-эмбрионов по сравнению с контрольными IVP-эмбрионами.223 Когда уровень транскриптов DNMT1 снизился за счет встраивания siRNA для DNMT1, метилирование уменьшилось, и количество эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, значительно увеличилось.223 В аналогичном исследовании SCNT-эмбрионы с пониженным уровнем siRNA DNMT1 показали рост до стадии бластоцисты, хотя не было никаких различий в их развитии до доношенного срока.217
Ооцит-зависимые эпигенетические аномалии
Аберрантные эпигенетические модификации, ведущие к аномалиям у эмбрионов, плодов и плаценты после переноса эмбрионов IVP или SCNT, могут первоначально возникать в гаметах. Больше внимания уделяется оценке потенциальных аберраций импринтингового статуса генов в ооците, а не в сперматозоидах, поскольку ооциты млекопитающих начинают приобретать свои материнские отпечатки (импринты) во время фолликулогенеза и завершают во время созревания ооцитов, происходящего непосредственно перед овуляцией.231 Для сравнения, сперматозоиды приобретают отцовские отпечатки in vivo во время сперматогенеза, и их ДНК упакована в очень защищенном виде. Однако, сперматозоиды, подвергнутые замораживанию и оттаиванию, а также процедурам разделения по полу, также могут подвергаться эпигеномным изменениям, поскольку они демонстрируют низкие темпы развития бластоцист во время производства эмбрионов IVP и низкие показатели стельности после ИО.232–236 При анализе двух специфических импринтированных генов, IGF2 и его рецептора IGF2R, не было обнаружено различий в паттернах метилирования ДНК в регуляторных, дифференциально метилированных участках этих генов между размороженными, несортированными и отсортированными по полу спермиями быков породы Нелоре.236 Кроме того, не было обнаружено различий в импринтах метилирования ДНК этих генов между неразделенными сперматозоидами и разделенными по полу X-несущими или Y- несущими сперматозоидами.236 Эти наблюдения подтверждают предположение, что импринты метилирования ДНК на отцовском геноме не повреждены до момента оплодотворения in vitro. Низкие параметры бластоцист и низкий процент наступления беременности после осеменения спермой, отсортированной по полу, могут быть результатом фрагментации ДНК, изменения процесса упаковки хроматина и эпигенетических дефектов метилирования ДНК внутри чередующихся повторов (последовательности нуклеотидных повторов идут не сразу одна за другой, а рассредоточены по всему геному и не являются смежными) или модификаций гистонов.236,237.
У млекопитающих материнские отпечатки приобретаются во время фолликулогенеза, и поэтому незрелые фолликулы, которые аспирируют и подвергают процедуре IVM, могут иметь измененные материнские отпечатки по сравнению с ооцитами, полностью созревшими и овулированными in vivo. Таким образом, использование систем IVM может быть фактором, способствующим аберрантной экспрессии импринтированных генов и аномалиям, связанным с возникновением AOS.
