Воспроизводство крупного рогатого скота

1. Macmillan K, Thatcher W. Влияние агониста гонадотропин-рилизинг-гормона на фолликулы яичников у крупного рогатого скота. Biol Reprod 1991;45:883–889.

2. Pursley J, Mee M, Wiltbank M. Синхронизация овуляции у молочных коров с использованием PGF2α и GnRH. Theriogenology 1995;44: 915–923.

3. Martinez M, Adams G, Bergfelt D, Kastelic J, Mapletoft R. Влияние LH или GnRH на доминантный фолликул первой фолликулярной волны у тёлок. Anim Reprod Sci 1999;57:23–33.

4. Colazo M, Gordon M, Rajamahendran R, Mapletoft R, Ambrose D. Частота наступления стельности после искусственного осеменения в фиксированное время у молочных коров, получавших гонадотропин-рилизинг-гормон или лютеинизирующий гормон свиного происхождения. Theriogenology 2009;72:262–270.

5. Deyo C, Colazo M, Martinez M, Mapletoft R. Применение GnRH или LH для синхронизации возникновения фолликулярной волны при суперовуляционной стимуляции у крупного рогатого скота. Theriogenology 2001;55:513 (Аннотация).

6. Wock J, Lyle L, Hockett M. Влияние применения гонадотропин-рилизинг-гормона по сравнению с эстрадиолом-17β в начале протокола суперовуляционной стимуляции на ответ на стимуляцию и качество эмбрионов. Reprod Fertil Dev 2008;20:228 (Аннотация).

7. Steel R, Hasler J. Сравнение трёх различных протоколов суперовуляционной стимуляции молочного скота. Reprod Fertil Dev 2009;21:246 (Аннотация).

8. Small J, Colazo M, Kastelic J, Mapletoft R. Влияние предварительной синхронизации с помощью прогестерона и применения eCG на частоту наступления стельности после искусственного осеменения в фиксированное время по протоколу на основе GnRH у мясного крупного рогатого скота. Theriogenology 2009;71: 698–706.

9. Pursley J, Martins J. Влияние концентрации прогестерона в крови и антрального возраста овуляторного фолликула на фертильность высокопродуктивных лактирующих молочных коров. Reprod Fertil Dev 2012; 24:267–271.

10. Nasser L, Sá Filho M, Reis E и др. Экзогенный прогестерон повышает качество яйцеклеток и эмбрионов после суперовуляционной стимуляции первой фолликулярной волны у доноров породы нелоре ( Bos indicus ). Theriogenology 2011;76:320–327.

11. Rivera F, Mendonca L, Lopes G и др. Сниженная концентрация прогестерона во время роста первой фолликулярной волны влияет на качество эмбрионов, но не влияет на их выживаемость после переноса у лактирующих молочных коров. Reproduction 2011;141: 333–342.

12. Bó G, Carballo Guerrero D, Tríbulo A и др. Новые подходы к вызыванию суперовуляции у коров. Reprod Fertil Dev 2010;22:106–112.

13. Barros C, Nogueira M. Суперовуляция у зебу: протокол P-36. IETS Embryo Transfer Newsletter 2005;23:5–9.

14. Nogueira M, Barros C. Время наступления овуляции у коров породы нелоре после суперовуляционной стимуляции по протоколу P-36. Acta Sci Vet 2003;31:509 (Аннотация).

15. Larkin S, Chesta P, Looney C, Bó G, Forrest D. Распределение сроков овуляции и последующая продукция эмбрионов при применении Lutropin и эстрадиола-17β для искусственного осеменения в фиксированное время самок мясного крупного рогатого скота после суперовуляционной стимуляции. Reprod Fertil Dev 2006;18:289 (Аннотация).

16. Martins C, Rodrigues C, Vieira L и др. Влияние времени индукции овуляции на продукцию эмбрионов у лактирующих коров голштинской породы после суперовуляционной стимуляции и искусственного осеменения в фиксированное время. Theriogenology 2012;78:974–980.

17. Baruselli P, Sá Filho M, Martins C и др. Суперовуляция и перенос эмбрионов у крупного рогатого скота Bos indicus.Териогенология 2006; 65:77–88.

18. Stoebel D, Moberg G. Повторяющийся острый стресс во время фолликулярной фазы и пика лютеинизирующего гормона у молочных тёлок. J Dairy Sci 1982;65:92–96.

19. Edwards L, Rahe C, Griffin J, Wolfe D, Marple D, Cummins K. Влияние стресса при транспортировке на функцию яичников у тёлок герефордской породы после суперовуляции. Териогенология 1987;28:291–299.

20. Bó G, Hockley D, Nasser L, Mapletoft R. Суперовуляторный ответ на однократное подкожное введение Folltropin-V у мясного крупного рогатого скота. Териогенология 1994;42:963–975.

21. Lovie M, Garcia A, Hackett A, Mapletoft R. Влияние схемы дозирования и способа введения Folltropin на суперовуляторный ответ у коров голштинской породы. Териогенология 1994; 41:241 (аннотация).

22. Sutherland W. Альгинат. В кн.: Byrom D (ред.) Биоматериалы: новые материалы из биологических источников . Нью-Йорк: Stockton Press, 1991, с. 307–333.

23. Tríbulo A, Rogan D, Tribulo H и соавт. Стимуляция развития фолликулов яичников у мясного крупного рогатого скота однократным внутримышечным введением Folltropin-V. Anim Reprod Sci 2011;129:7–13.

24. Tríbulo A, Rogan D, Tríbulo H, Tríbulo R, Mapletoft R, Bó G. Суперовуляция у мясного крупного рогатого скота при однократном внутримышечном введении Folltropin-V, разделённом на две дозы, с двумя концентрациями гиалуронана. Териогенология 2012;77:1679–1685.

25. Hasler J, Hockley D. Эффективность гиалуронана в качестве разбавителя при двухинъекционной схеме суперовуляции с применением ФСГ у мясных коров Bos taurus. Reprod Domest Anim 2012;47:459 (аннотация).

Глава 76

Сбор и пересадка эмбрионов

Эдвин Г. Робертсон

Harrogate Genetics International, Харрогейт, Теннесси, США

Вступление

Подобно тому, как слоган Burger King «Have It Your Way» (Сделай по-своему) применим к фаст-фуду, опытный практикующий специалист по сбору эмбрионов также скажет, что он применим к технике сбора эмбрионов крупного рогатого скота. С тех пор, как доктора Robert Rowe, Peter Elsden и Martin Drost сообщили об успешном нехирургическом заборе эмбрионов крупного рогатого скота в 1976 году, перенос эмбрионов стал обычной практикой в животноводстве. После посещения доктора Rowe в сентябре 1977 года в Миддлтоне, штат Висконсин, для наблюдения за его техникой, за последующие 36 лет я собрал более 180 000 эмбрионов от 30 000 коров и пересадил более 80 000 эмбрионов. За это время мои техники эволюционировали. Обучая новичков и посещая других практиков, чтобы наблюдать за их техниками, я быстро понял, что «мой путь» не был «единственным путем». Выбор процедуры, удобной для ваших рук, приведет к уверенности, которая приведет к тому, что вы станете успешным практикующим специалистом по переносу эмбрионов.

Я наблюдал за методами переноса эмбрионов по всему миру и могу честно сказать, что многие методы можно использовать для успешного сбора и пересадки. Однако, я предпочитаю «простой», «легкий» и «быстрый», поэтому на протяжении всей своей карьеры я всегда искал методы, которые ограничивают мою подверженность ошибкам, а также те, которые экономят время. Итак, техники, которые я опишу, - это «мой путь», самые эффективные и действенные техники в моих руках. Надеюсь, вы почерпнете несколько полезных идей, которые повысят ваши навыки и производительность.

В предыдущих главах обсуждалась суперовуляция, место оплодотворения и транспортировка спермы вверх по яйцеводу и эмбриона / яйцеклетки вниз по яйцеводу в матку. Мы начнем наше обсуждение, предполагая, что эмбрионы попали в матку к 4.5 или 5.0 дню.

Тайминг

Поскольку эмбрионы наиболее универсальны на 6-7 день, большинство практикующих врачей планируют сбор через 6,5-7 дней после того, как у донора впервые зафиксируют рефлекс неподвижности.

Когда сбор должен быть произведен у нескольких доноров в один и тот же день, обычно разница в наступлении стоячей охоты между ними составляет не менее 12-24 часов. Так как эмбрионы могут вылупиться к 7,5–8,0 дням и стать менее пригодными для использования, обычно целесообразно сначала собрать доноров, у которых проявился стоячий жар раньше всего. Также помните, что сбор на 6-й день или ранее может привести к тому, что эмбрионы будут слишком незрелыми, чтобы очень хорошо выдержать процесс замораживания.

Среды для сбора эмбрионов

Сегодня доступны многие готовые коммерческие среды для сбора эмбрионов. Я использую готовую к применению среду Vigro Complete Flush™ компании Bioniche, содержащую поверхностно-активное вещество (поливиниловый спирт) и антибиотики (гентамицин и канамицин). Некоторые специалисты используют имеющийся в их ветеринарных клиниках раствор Рингера с лактатом и просто добавляют 0.1% бычьего сывороточного альбумина в качестве поверхностно-активного вещества. При кратковременном хранении это, по-видимому, хорошо работает и обходится значительно дешевле.

Если эмбрионы собирают для экспорта, в некоторых странах запрещено добавлять продукты животного происхождения, такие как бычий сывороточный альбумин (из-за опасений, связанных с губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота, или BSE). В таких случаях допустимо использовать готовую среду, в которой поверхностно-активным веществом служит поливиниловый спирт.

Подготовка доноров

В первые годы работы я возил с собой на фермы наклонную платформу и устанавливал её в станке либо просил владельца скота приподнять переднюю часть станка на 30–35 cm. Приподнятое положение смещает внутренние органы назад и способствует подъёму матки, облегчая доступ к ней для манипуляций. Кроме того, на собственном горьком опыте я усвоил урок относительно лишения доноров и реципиентов корма. Хотя идея сократить потребление корма до моего приезда, чтобы уменьшить количество каловых масс, казалась разумной, я быстро понял, что один из лучших помощников специалиста по пересадке эмбрионов — наполненный рубец. Наполненный рубец не только приподнимает матку и смещает её каудально, но и предотвращает отрицательное давление в брюшной полости, возникающее при пустом рубце. Из-за отрицательного давления в брюшной полости воздух

засасывается вдоль руки в прямую и ободочную кишку во время промывания, что сильно затрудняет манипуляции с маткой. Наклонная платформа и корм — два больших помощника.

После того как донор оказывается в станке или стойле с фиксацией, проводят эпидуральную анестезию лидокаином (3–5 mL), используя иглу 3.75 cm × 18-го калибра. На мой взгляд, подготовка к эпидуральной анестезии не требуется. Стрижка или мытьё шерсти мало что дают, если не проводить хирургическую подготовку области корня хвоста. Я никогда не провожу никакой подготовки к эпидуральной анестезии ни у доноров, ни у реципиентов. Сразу после неё я пальпирую каждый яичник и записываю предполагаемое число жёлтых тел на каждом из них. Также отмечаю неовулировавшие фолликулы и размеры яичников, если они необычны. Эти сведения полезны после получения результатов — как хороших, так и плохих.

Седацию одни считают помощником, другие — помехой. Чаще всего непосредственно перед эпидуральной анестезией я подкожно или внутримышечно ввожу 10 mg (0.1 mL) препарата Rompun (ксилазин). Хотя он немного повышает тонус матки, я никогда не считал это проблемой. Я собирал эмбрионы у многих коров и без ксилазина, но предпочитаю его применять: он успокаивает возбудимых коров и облегчает мне работу, поскольку они стоят спокойно на протяжении всей процедуры сбора.

Я никогда не применяю дезинфицирующие средства (они здесь враги) рядом с материалами для сбора эмбрионов. После того как хвост подвязан в сторону, я просто протираю область промежности. Если воды нет, я просто начисто протираю эту область одноразовым полотенцем. После такой подготовки корова готова к сбору эмбрионов.

Оборудование (и поставщик)

• Катетер: силиконовый, 52 cm, размер 16 по французской шкале, с манжетой 5-mL (Bioniche).

• Стилет: из нержавеющей стали, 60 cm (Bioniche).

• Y-образная трубка: пластиковая, 150 cm; один конец снабжён наконечником для шприца, другой присоединяется к фильтру EZ Flow (Pets-inc).

• Одноразовый пластиковый трёхходовой кран (Pets-inc).

• Герметичный шприц объёмом 50 или 60 mL (Pets-inc).

• Фильтр для эмбрионов EZ Flow (Pets-inc).

• Гель KY (без спермицидных компонентов).

• Расширитель шейки матки: инструмент Harrogate AI/ET для искусственного осеменения и пересадки эмбрионов и расширения шейки матки (Stone Mfg. Co.).

• Среда: Vigro Complete (Bioniche).

• Шприц объёмом 10-mL для раздувания манжеты.

Стерилизация

Большинство оборудования стерилизует изготовитель гамма-излучением. Много лет назад выяснилось, что оксид этилена токсичен для эмбрионов, и его больше не используют. Если катетеры и трубки нельзя автоклавировать, достаточно просто вымыть их лабораторным моющим средством Alconox™ и несколько раз ополоснуть дистиллированной водой. Многие специалисты выбрасывают всё оборудование после однократного использования. Я повторно использую всё, что возможно, с учётом стоимости.

Сбор эмбрионов

Выбор катетера зависит от того, какую часть матки промывают (рог или тело), а также от возраста и размера коровы. На протяжении многих лет я использовал стандартный латексный катетер Фолея для людей длиной 45 cm и размером 16 или

18 по французской шкале для промывания матки у коров любого размера. Сегодня у нас есть широкий выбор средств, делающих сбор эмбрионов проще и удобнее. Сейчас для всех промываний я использую силиконовый катетер длиной 52 cm, размером 16 или 18 по французской шкале, с баллоном 5-mL (Bioniche). Баллон 5-mL при необходимости можно раздуть до 20 mL; при этом он принимает более округлую и чётко очерченную форму, чем баллон 30-mL, который при раздувании становится более вытянутым (рисунок 76.1).

Установка катетера — первый критически важный этап нехирургического сбора эмбрионов. Я опишу установку катетера и процедуру сбора как при промывании одного рога, так и при промывании тела матки (рисунок 76.2). Необходимо учитывать следующее. Донор — тёлка, которая ещё не телилась, или корова? Если тёлка, насколько развиты её половые органы? Здоровы ли половые органы донора или имеются отклонения? Если отклонения есть (напримерg, спайки, деформации, инфекция; также следует учитывать породу и возраст), каковы они и как могут повлиять на сбор? Каков темперамент донора? Какие условия имеются для промывания?

Сначала поговорим об обычной процедуре сбора, а затем обсудим особые обстоятельства, отклонения и профессиональные приёмы. Эксперты учат банковских кассиров выявлять фальшивые деньги, сначала показывая им, как выглядят настоящие: тогда они могут заметить любое отклонение. Именно так я предпочитаю подходить к сложным случаям сбора эмбрионов. Когда вы научитесь эффективно и уверенно работать с обычными коровами, при возникновении трудностей вы, надеюсь, не запаникуете, а грамотно справитесь с ними и успешно завершите сложную процедуру сбора.

Чтобы катетер стал достаточно жёстким для проведения через шейку матки, в него необходимо вставить металлический стилет. Перед введением стилета в катетер на его кончик наносят небольшое количество геля KY, чтобы облегчить извлечение стилета после проведения катетера. Стилет должен быть немного длиннее катетера (стилет 60-cm, катетер 52-cm), чтобы катетер можно было натянуть и стилет плотно прилегал к его внутренним стенкам (рисунок 76.3). Это не позволяет кончику стилета случайно выйти через одно из отверстий для жидкости рядом с кончиком катетера при проведении через шейку матки. Повреждение шейки матки и маточное кровотечение — наши враги. Катетер проводят примерно так же, как при искусственном осеменении (AI), но катетер значительно толще. Кроме того, катетер необходимо удерживать натянутым: иначе давление пальцев на шейку матки может вытолкнуть кончик стилета из просвета через боковое отверстие у кончика катетера.

Рано или поздно каждому специалисту встречается искривлённая шейка матки, через которую не удаётся провести катетер. Незаменимый инструмент в таком случае — расширитель шейки матки. Я никогда не отправляюсь на выезд без него, хотя использую его, возможно, лишь раз или два в год. Компания Stone Mfg. Co. изготовила расширитель по моей разработке и продаёт его как инструмент Harrogate AI/ET для искусственного осеменения и пересадки эмбрионов и расширения шейки матки. (Примечание редактора : Изделие № 10050, Stone Mfg, 1212 Kansas Ave, Канзас-Сити, Миссури 64127. inquiries@ stonemfg.net.) Расширитель можно провести даже через шейку матки с самым трудным доступом. Затем, пока ассистент извлекает расширитель, можно быстро провести катетер, прежде чем шейка матки успеет вернуться к своей аномальной форме. Расширители особенно полезны при работе с животными породы браман и её помесями: с возрастом у них нередко появляются S-образные изгибы и/или изгибы шейки матки под углом 90° (рисунок 76.4).

Проведение катетера через труднопроходимую или искривлённую шейку матки требует упорства. На стилет необходимо постоянно надавливать в направлении вперёд. Сдавливая каждую складку шейки матки перед