( n = 326) сопоставимо с ранее отмеченным снижением частоты стельности на 10–15%,44,45а также с различием между средними показателями, опубликованными Американской ассоциацией переноса эмбрионов и Международной ассоциацией переноса эмбрионов (Савой, штат Иллинойс). Результаты двух исследований показывают, что частота стельности у коров, получивших свежий эмбрион категории 1 или категории 2,46,47не различалась. В предыдущих публикациях48–51отмечалось снижение частоты стельности с каждым снижением оценки качества.
Показано, что частота стельности зависит от синхронности половой охоты у донора и реципиента. Более высокая частота стельности наблюдалась, когда половая охота у реципиента наступала одновременно с донором или на 12 ч раньше. Частота стельности снижалась у реципиентов, у которых половая охота наступала на 12 ч позже, чем у донора,50хотя, согласно другим публикациям, снижение наблюдалось лишь при задержке на 24 ч.45–47
Различия в концентрации прогестерона у реципиентов отражают сочетание различий в скорости развития жёлтого тела (CL) и колебаний секреции прогестерона в раннюю лютеиновую фазу. Предполагается, что оптимальная для наступления стельности концентрация прогестерона в крови составляет от 2.0 до 5.0 нг/mL.52Однако недавнее исследование показало, что минимальная пороговая концентрация прогестерона в день переноса эмбриона, необходимая для наступления и сохранения стельности, может быть ниже, чем сообщалось ранее: частота стельности не различалась при концентрации прогестерона как на уровне 0.58 нг/mL, так и выше 16.0 нг/mL ( n = 448).47В другом исследовании у 8 из 177 стельных реципиентов концентрация прогестерона была ниже 0.5 нг/mL на 10-й, 11-й и 12-й дни цикла переноса.53Кроме того, диаметр и объём жёлтого тела различались у реципиентов, которым переносили эмбрионы через 6.5–8.5 дней после половой охоты,47увеличиваясь по мере удлинения периода после половой охоты. Однако частота стельности у реципиентов, которым переносили эмбрионы через 6.5–8.5 дней после половой охоты, не различалась.
Движения реципиента, когда инструмент для переноса эмбрионов находится в матке, повышают риск повреждения эндометрия и вызывают высвобождение PGF2α. Обнаружена обратная зависимость между частотой стельности и временем нахождения инструмента в матке при переносе эмбриона.54Кроме того, сообщалось о повышении частоты стельности при введении ингибитора синтеза простагландинов флуниксина меглумина во время переноса эмбрионов, но только при переносе эмбрионов более низкого качества.43,55Однако Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) напомнило, что флуниксина меглумин разрешён для крупного рогатого скота только при внутривенном введении, а применение препарата не по инструкции приводило к повышенному содержанию его остатков, выявляемых при убое.
Общие требования к реципиентам
Отбор и выявление высококачественных реципиентов — непростая задача. Многие предпочитают использовать тёлок, которые ещё не телились, тогда как другие выбирают коров с подтверждённой историей высокой фертильности. Если в качестве реципиентов планируется использовать тёлок, критерии их отбора должны быть такими же, как для высококачественных ремонтных тёлок. У тёлок должен быть половой цикл (что можно косвенно оценить по состоянию репродуктивных органов56), они должны получать полноценное кормление, иметь тазовый канал достаточного размера и нормальной формы, а также не должны ранее получать имплантаты со стимуляторами роста.
У лактирующих реципиентов есть преимущество — их репродуктивный анамнез известен. Поскольку здоровье телёнка зависит от
реципиента, необходимо вести записи о здоровье телят и их показателях к моменту отъёма. Реципиентов, которые выносили телёнка после пересадки эмбриона, но не вырастили нормального телёнка до отъёма, следует повторно оценить на пригодность к этой роли. Аналогичным образом, яловых коров с неизвестным репродуктивным анамнезом необходимо тщательно обследовать, прежде чем включать их в стадо или программу реципиентов.57 Репродуктивные органы необходимо тщательно обследовать методом ректальной пальпации или трансректального ультразвукового исследования на наличие беременности либо аномалий матки, таких как жидкость или остатки плода, а также признаков метрита или эндометрита. Яичники следует обследовать на наличие нормальных фолликулярных или лютеиновых структур. Кроме того, у реципиентов должны быть здоровые зубы и глаза, хорошо развитое вымя и правильное телосложение; их возраст должен быть менее 8 лет. Наивысшая плодовитость наблюдается в стадах, где оборудование для работы с животными устроено так, чтобы свести стресс к минимуму.
Новых животных целесообразно держать отдельно от племенного стада до получения результатов диагностических исследований и истечения срока, достаточного для проявления заболеваний в инкубационном периоде. Многие заводчики чистопородного скота и компании по пересадке эмбрионов берут образцы крови для проверки на контакт с вирусом лейкоза крупного рогатого скота (BLV), Mycobacterium paratuberculosis (возбудителем болезни Йоне), вирусом вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), возбудителями анаплазмоза и Neospora caninum. Во многих районах проверка на бруцеллёз или вакцинация против него больше не требуется, однако скот из районов, где заболевание встречается у диких животных, разумно обследовать. Многие из этих возбудителей связаны со снижением плодовитости: они препятствуют оплодотворению или вызывают гибель эмбрионов, потерю плода либо нарушение функции яичников.58 Вакцинация для борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных — распространённая и проверенная практика. Согласно традиционным рекомендациям, вакцины с модифицированными живыми вирусами следует вводить как минимум за 30 дней до осеменения. Однако недавние исследования показали, что у ранее вакцинированного скота вакцинация во время обработки PGF2α или первоначальной обработки GnRH не оказывает неблагоприятного воздействия.58 Животные с неизвестной или сомнительной историей вакцинации должны получить первичную и повторную прививки как минимум за 30 дней до осеменения.59
Содержание после подтверждения беременности
После подтверждения беременности реципиентку необходимо содержать так, чтобы беременность сохранилась. В зависимости от региона, где содержится корова, существуют различные факторы окружающей среды, способные вызвать аборт. К ним относятся N. caninum, ядовитые растения, известные как locoweed, хвоя сосны жёлтой, токсическое действие овсяницы, нитраты, микотоксины и/или заплесневелые корма. Показано, что стресс при обращении с животными может вызывать аборты у тёлок, однако достоверных данных об оптимальном сроке перевозки реципиентов после пересадки эмбриона нет. При этом частота наступления беременности у самок, перевезённых между 8 и 33 днями после искусственного осеменения, была ниже, чем у перевезённых в течение первых 4 дней.60 Следовательно, перевозить реципиентов до выхода эмбриона из оболочки, по-видимому, предпочтительнее, чем после него. Инфекционные агенты (например, BVDV, возбудитель инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и, в редких случаях, вирус катаральной лихорадки овец (e.g.)) также представляют угрозу для развивающегося плода. Причину аборта часто установить невозможно, но вероятность успешной диагностики повышается, если представить надлежащие образцы и сведения из анамнеза.61
Биобезопасность
Чтобы защитить стадо от заноса инфекционных болезней, способных вызвать аборты или снизить ценность телят, необходима продуманная программа биобезопасности. Она должна включать обследование и карантин всех вновь поступающих в стадо животных. Снизить риск заноса возбудителей на ферму помогают простые меры: использование одноразовых игл и ректальных перчаток, дезинфекция оборудования между обработками коров (устройств для введения препаратов через рот, татуировочных щипцов и других инструментов), борьба с наружными паразитами, чистая спецодежда для работников и посетителей, а также дезинфицирующие ванны для обуви или бахилы. Кроме того, оборудование и одежду нельзя переносить с одной фермы на другую без предварительной тщательной мойки и дезинфекции.
Диагностика беременности
Знание сроков зачатия и ожидаемого отёла помогает сосредоточить наблюдение в период отёлов. Ультразвуковое исследование позволяет достоверно определить наличие зародыша уже через 28 дней, но для подтверждения беременности рекомендуется повторно обследовать всех коров после 45 дней.62 По результатам ультразвукового исследования и датам осеменения можно определить предполагаемые даты отёла, распределить коров по группам в зависимости от сроков отёла и организовать их содержание так, чтобы сократить расходы на корма, труд и ветеринарное обслуживание. Сроки вакцинации перед отёлом также можно подобрать так, чтобы обеспечить наиболее эффективный ответ. Кроме того, показано, что предотвращение скученности на пастбищах, используемых для отёлов, и/или проведение отёлов на «свежих» пастбищах, где не паслись коровы с телятами, снижает заболеваемость и смертность телят от инфекционной диареи.63
Организация эффективного использования реципиентов
Эффективное ведение стада реципиентов требует подготовки животных к получению эмбриона, а также выявления и подготовки яловых коров к повторной синхронизации и использованию либо к осеменению. В любой группе реципиентов после синхронизации небольшая доля животных не будет выявлена в состоянии охоты, а эмбрионы будут пересажены не всем животным с выявленной охотой — из-за несвоевременного наступления охоты или отсутствия подходящего жёлтого тела на момент пересадки. Если охота выявлена у 80% реципиентов после синхронизации, эмбрионы получат 90% из них, а беременность наступит у 60%, то беременными станут менее 45% животных в любой группе реципиентов. Поэтому важно разработать стратегию как можно более ранней повторной синхронизации реципиентов.
В крупных стадах с продолжительным сезоном отёлов необходимо синхронизировать несколько групп реципиентов. Стратегии повторной синхронизации различаются в зависимости от ресурсов и возможностей хозяйства. С помощью ультразвукового исследования небеременных реципиентов можно уверенно выявить и повторно синхронизировать уже через 3 недель после пересадки эмбриона.64 Устройство CIDR также можно ввести во время пересадки и удалить спустя 12–13 дней; перед повторным использованием реципиента беременность можно диагностировать с помощью ультразвукового исследования.
Мы не пересаживаем эмбрион одному реципиенту более двух раз за сезон. Неопубликованные данные Granada BioSciences Inc. (Маркес, штат Техас) показали, что частота наступления беременности у реципиентов после одной и после двух пересадок существенно не различалась,
однако после третьей пересадки эмбриона беременность наступила менее чем у 20% реципиентов. Вместе с тем в одной публикации сообщалось о снижении частоты наступления беременности у реципиентов после второй пересадки эмбриона на величину до 12%.65
Многие заводчики чистопородного скота заключают договоры с товарными хозяйствами, занимающимися выращиванием телят на подсосе, об использовании их коров в качестве реципиентов и покупке отнятых от матерей телят, полученных после пересадки эмбрионов. Обычно партнёр по договору синхронизирует охоту у коров и наблюдает за её проявлением, отбирает реципиентов через 6–8.5 дней после охоты и предоставляет работников, которые проводят коров через станок для пересадки эмбрионов специалистом. Заводчик чистопородного скота оплачивает расходы на синхронизацию и работу специалиста по пересадке эмбрионов, а владельцу коров выплачивает дополнительное вознаграждение за каждого отнятого от матери телёнка, полученного после пересадки эмбриона. Такое соглашение может быть выгодно обеим сторонам. Однако на начальном этапе программы возникают определённые трудности. Не у всех товарных хозяйств организация работы соответствует необходимому уровню; подходящим участником такой программы может стать хозяйство, уже имеющее опыт искусственного осеменения. Крайне важно, чтобы производитель вёл надлежащий учёт, мог взвесить и идентифицировать каждого телёнка при рождении, уверенно выявлял охоту и имел действенную программу охраны здоровья стада. В целях биобезопасности заводчик чистопородного скота может ожидать от партнёра обследования коров на упомянутые выше заболевания.
Опрос Американской ассоциации по пересадке эмбрионов
В 2011 мы провели опрос всех членов Американской ассоциации по пересадке эмбрионов (AETA), которые считаются ведущими специалистами по пересадке эмбрионов крупного рогатого скота в США. Цель опроса состояла в оценке распространённости современных методов пересадки эмбрионов, отношения членов AETA к каждому методу и того, подтверждаются ли их представления результатами исследований. Анкету получили в общей сложности 218 профессиональных членов ассоциации; ответили 63 (29%). Из ответивших 47 (75%) были сертифицированными членами AETA. При этом 27 (43%) отнесли свою деятельность по пересадке эмбрионов преимущественно к мясному крупному рогатому скоту, 13 (21%) — к молочному скоту, 21 (34%) — одновременно к мясному и молочному скоту, а деятельность одного члена ассоциации (2%) не была связана с крупным рогатым скотом. Мы попросили участников опроса оценить предполагаемое влияние ряда факторов на плодовитость реципиентов при пересадке эмбрионов; результаты представлены на рисунке 78.3. Наибольшее влияние на плодовитость участники приписали качеству эмбриона. Категория качества эмбриона оказывает огромное влияние на плодовитость: в исследовании, где сравнивали частоту наступления беременности после пересадки эмбрионов категорий от 1 до 3 (1 — отличное качество, 3 — низкое), у реципиентов, получивших эмбрионы категории 1, беременность наступала чаще, чем у получивших эмбрионы категории 3 (56.1% против 33.3% соответственно).66 Квалификацию специалиста по пересадке эмбрионов оценили как второй по значимости фактор, влияющий на плодовитость при пересадке: частота наступления беременности действительно различается у разных специалистов67 и находится в обратной зависимости от времени, затраченного на манипуляции в матке во время пересадки эмбриона.54
Упитанности реципиента на момент пересадки эмбриона приписали умеренное влияние на плодовитость; влияние питания на успешность программ пересадки эмбрионов обсуждалось в разделе, посвящённом кормлению. Хотя влияние оценили как умеренное,
Диаметр жёлтого тела 2.4
Стадия развития эмбриона 2.5
Свежий или замороженный эмбрион 3.3
Место размещения эмбриона 3.3
Возраст реципиента 3.4
Анамнез реципиента 3.5
Упитанность при пересадке эмбриона 3.7
Специалист по пересадке эмбрионов 4.1
Качество эмбриона 4.2
1 2 3 4 5
Слабое влияние Сильное влияние
Рисунок 78.3 Оценка относительного влияния факторов на плодовитость реципиентов при пересадке эмбрионов (1 — наименьшее влияние, 5 — наибольшее). BCS — оценка упитанности; ET — пересадка эмбриона.
использование свежих или замороженных эмбрионов, а также стадия развития эмбриона при пересадке и анамнез реципиента оказывают большое влияние на результативность программ пересадки эмбрионов.67 Считается, что диаметр жёлтого тела слабо влияет на плодовитость реципиентов при пересадке эмбрионов. Действительно, в исследовании лютеиновых характеристик и концентрации прогестерона в плазме крови беременных и небеременных реципиентов различий в диаметре жёлтого тела, объёме лютеиновой ткани и концентрации прогестерона в плазме не обнаружили.47
Удивительно, что 61% участников опроса заявили об отсутствии опыта применения хорионического гонадотропина человека (hCG), 23% сочли его применение безрезультатным и лишь 16% полагали, что применение hCG в программах пересадки эмбрионов эффективно. Тем не менее наша недавняя работа68 показала, что введение hCG при пересадке эмбриона повышало частоту образования дополнительных жёлтых тел, концентрацию прогестерона у беременных реципиентов и частоту наступления беременности после пересадки. В трёх местах проведения исследования реципиентами служили чистопородные и помесные животные пород ангус, симментальская и герефордская (n = 719) поочерёдно назначали внутримышечное введение hCG 1000 IU или физиологического раствора 1 mL (контроль) при переносе эмбриона. При первой диагностике на день 33 доля стельных животных составила 61.8 и 53.9% в группах hCG и контроля соответственно (рисунок 78.4), а при второй диагностике на день 68 — 59.0 и 51.4% соответственно. В соответствии с нашими результатами применение hCG при переносе эмбрионов также повысило долю стельных животных среди коров-реципиентов голштинской породы при переносе эмбрионов в фиксированные сроки.69
На вопрос о влиянии флуниксина меглумина (FM), ингибитора синтеза простагландинов, на фертильность реципиентов при переносе эмбрионов 53% участников опроса ответили, что применение FM не принесло успеха, 18% сообщили, что не имеют опыта применения FM, и лишь 29% оценили применение FM в программах переноса эмбрионов как успешное. В исследовании влияния FM при введении перед переносом эмбрионов доля стельных животных была выше среди реципиентов, получивших инъекцию FM. Однако результаты различались в зависимости от места проведения исследования.43 В другом исследовании применение FM повысило общую долю стельных реципиентов (65.3% против 60.2% в группе FM и контрольной группе соответственно), причём влияние FM, по-видимому, было ещё более благоприятным при переносе эмбрионов класса 2.70
80 Физиологический раствор hCG
70 **
64.5
61.3 61.8
60
55.6 55.6
53.7 53.9
50.1
50
40
30
Место проведения 1 Место проведения 2 Место проведения 3 В целом
Место проведения
Доля стельных животных, %
Рисунок 78.4 Влияние введения hCG 1000 IU при переносе эмбрионов на долю стельных животных на день 33 (данные по свежим и замороженным эмбрионам объединены). ** — показатели в группе hCG отличаются от показателей в группе физиологического раствора, P = 0.03). Адаптировано по: Wallace L, Breiner C, Breiner R и др. Введение хорионического гонадотропина человека при переносе эмбриона вызывало овуляцию доминантного фолликула первой волны и повышало уровень прогестерона и долю стельных животных после переноса эмбрионов. Theriogenology 2011;75:1506–1515.
Наконец, мы спросили участников, насколько успешными они считают программы переноса эмбрионов в фиксированные сроки (FTET): 73% ответили, что FTET успешен, 14% — что FTET неуспешен, а 13% не имели опыта применения FTET. Применение протоколов синхронизации устраняет необходимость выявлять охоту и увеличивает число животных, которым переносят эмбрионы. Большинство современных протоколов FTET основано на применении устройств, высвобождающих прогестаген, в сочетании с эстрадиолом или GnRH; это позволяет контролировать и синхронизировать динамику фолликулярных волн и овуляцию. Сообщалось, что частота зачатия после одного FTET сходна с таковой после выявления охоты (рисунок 78.5); однако доля стельных животных выше, поскольку эти методы увеличивают долю реципиентов, которым переносят эмбрион.66
Заключение
Для эффективности программы переноса эмбрионов необходимо обеспечить множество условий. Питание, контроль полового цикла и содержание реципиентов — всё это
