Воспроизводство крупного рогатого скота

разнообразия стадий развития и классов качества эмбрионов. Наиболее надёжный показатель, позволяющий прогнозировать частоту наступления беременности после пересадки эмбриона, — его класс качества: эмбрионы класса качества 1 обеспечивают более высокую частоту наступления беременности, чем эмбрионы класса качества 2 или 3. Ожидается, что замороженные и затем размороженные эмбрионы на стадиях от компактной морулы (код стадии 4) до бластоцисты (код стадии 6) будут обеспечивать сопоставимую частоту наступления беременности при пересадке синхронизированным самкам-реципиентам. Точное ведение учёта позволит специалистам по пересадке эмбрионов отслеживать результаты своей работы и выявлять аспекты, требующие улучшения.

Краткие итоги

Пересадка эмбрионов — репродуктивная биотехнология, способствующая быстрому генетическому улучшению молочного и мясного крупного рогатого скота. Важным фактором, определяющим общий успех пересадки эмбрионов, является качество эмбрионов, полученных от самок-доноров после суперовуляции. Хотя за прошедшие годы для оценки качества эмбрионов применяли различные методы, единственным проверенным и признанным в отрасли методом остаётся морфологическая оценка. Цель этой главы — предоставить читателям сведения, необходимые для точной морфологической оценки качества эмбрионов крупного рогатого скота. Чтобы уверенно овладеть этим методом, требуется значительный опыт, однако освоить его важно, поскольку качество эмбрионов позволяет прогнозировать частоту наступления беременности после их пересадки.

Список литературы

1. Hartman C, Lewis W, Miller F, Swett W. Первые обнаружения яйцеклеток в маточных трубах коровы с замечаниями об эструсе. Anat Rec 1931;48:267–275.

2. Winters, L, Green W, Comstock R. Пренатальное развитие крупного рогатого скота. Технический бюллетень 151, Сельскохозяйственная опытная станция Миннесотского университета, 1942.

3. Hamilton W, Laing J. Развитие яйцеклетки коровы до стадии образования бластоцисты. J Anat 1946;80:194–204 и таблицы иллюстраций.

4. Shea B, Hines D, Lightfoot D, Ollis G, Olson S. Пересадка эмбрионов крупного рогатого скота. В кн.: Rowson LEA (ред.) Пересадка эмбрионов у крупного рогатого скота . Люксембург: издание ЕЭС 5491, 1976, с. 145–152.

5. Trounson A, Willadsen S, Rowson L. Влияние культивирования in vitro и охлаждения на выживаемость и развитие эмбрионов коров. J Reprod Fertil 1976;47:321–327.

6. Renard P, Menezo Y, Saumande J, Heyman Y. Попытки прогнозирования жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота, полученных после суперовуляции. В кн.: Streenan JR (ред.) Управление воспроизводством у коров . Актуальные вопросы ветеринарной медицины, т. 1. Берлин: Springer Verlag, 1977, с. 398–417.

7. Kardymovicz O. Метод прижизненного окрашивания для определения жизнеспособности оплодотворённых яйцеклеток овец, хранившихся in vitro. В кн.: Материалы

7-го Международного конгресса по воспроизводству животных и искусственному осеменению, Мюнхен, Германия , 1972, с. 503–506.

1. Renard J, Philippon A, Menezo Y. Поглощение глюкозы бластоцистами крупного рогатого скота in vitro. J Reprod Fertil 1980;58:161–164.

2. von Schilling E, Niemann H, Cheng SP, Doepke H-H. DAPI: ещё один флуоресцентный тест для определения жизнеспособности эмбрионов коров и кроликов на ранних стадиях развития. Reprod Domest Anim 1979;14:170–172.

3. Youngs C, Pendleton R, Rorie R, Godke R. Использование компьютеризированной системы анализа изображений для фотометрических и морфометрических измерений эмбрионов крупного рогатого скота до имплантации. Theriogenology 1987;27:299 (аннотация).

4. von Schilling E, Döpke H. Экспресс-тест для определения жизнеспособности ранних эмбрионов крупного рогатого скота и кроликов с использованием диацетата флуоресцеина. Naturwissenschaften 1978;65:658–659.

5. Hoppe R, Bavister B. Оценка теста жизнеспособности с витальным красителем диацетатом флуоресцеина (FDA) на эмбрионах хомяков и крупного рогатого скота. Anim Reprod Sci 1984;6:323–335.

6. von Schilling E, Niemann H, Smidt D. Оценка свежих и замороженных эмбрионов крупного рогатого скота методом флуоресцентной микроскопии. В кн.: Hafez ESE, Semm K (ред.) Оплодотворение in vitro и трансплантация эмбрионов . Нью-Йорк: Alan R. Liss, 1982, с. 349–355.

7. Boland M. Использование яйцевода кролика для предварительной оценки жизнеспособности яйцеклеток млекопитающих. Theriogenology 1984;21:126–137.

8. Shea B. Оценка эмбрионов крупного рогатого скота. Theriogenology 1981;15:31–42.

9. Scenna F, Munar C, Mujica I и соавт. Факторы, влияющие на частоту наступления беременности после программы трансплантации эмбрионов в запланированные сроки у крупного рогатого скота в производственных условиях. Reprod Fertil Dev 2009;21:172 (аннотация).

10. Lindner G, Wright R. Морфология и оценка эмбрионов крупного рогатого скота. Theriogenology 1983;20:407–416.

11. Stringfellow D, Seidel S. Руководство Международного общества трансплантации эмбрионов , 3-е изд. Шампейн, Иллинойс: Международное общество трансплантации эмбрионов, 1998.

12. Stringfellow D. Рекомендации по санитарной обработке эмбрионов, полученных in vivo. В кн.: Stringfellow DA, Givens MD (ред.) Руководство Международного общества трансплантации эмбрионов , 4-е изд. Шампейн, Иллинойс: Международное общество трансплантации эмбрионов, 2010, с. 65–68.

13. Stringfellow D, Givens M. Руководство Международного общества трансплантации эмбрионов , 4-е изд. Шампейн, Иллинойс: Международное общество трансплантации эмбрионов, 2010.

14. Stroud B. Отчёт об исследовании AETA за 2009 г. http://www.aeta.org/ docs/09statsreport.pdf. Загружено в январе 13 г., 2013.

15. Steel R, Hasler J. Частота наступления беременности после трансплантации свежих и замороженных эмбрионов коров голштинской и джерсейской пород. Reprod Fertil Dev 2004;16:182–183 (аннотация).

16. Farin P, Britt J, Shaw D, Slenning B. Согласованность оценок специалистов при исследовании эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vivo или in vitro. Theriogenology 1995;44:339–349.

17. Spell A, Beal W, Corah L, Lamb C. Оценка факторов, связанных с реципиентами и эмбрионами, которые влияют на частоту наступления беременности после трансплантации эмбрионов у мясного крупного рогатого скота. Theriogenology 2001;56:287–297.

18. Hasler J. Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота: повышается ли её эффективность? В сб.: Материалы конференции «Прикладные стратегии воспроизводства мясного крупного рогатого скота», Нэшвилл, штат Теннесси , 2010, с. 265–282.

19. Hasler J. Современное состояние и перспективы получения ооцитов, производства эмбрионов in vitro и трансплантации эмбрионов у домашних животных с особым вниманием к крупному рогатому скоту. J Anim Sci 1998;76(прил. 3):52–74.

Глава 80

Борьба с патогенами, переносимыми эмбрионами

Julie Gard

Кафедра клинических наук, Колледж ветеринарной медицины, Обернский университет, Оберн, Алабама, США

Введение

Эмбрионы подвержены загрязнению из многочисленных источников, включая донора, сперму, среды для культивирования и промывания, а также белки животного происхождения, используемые в составе сред. Эти патогены эмбрионов могут существенно влиять на клиническую эффективность технологий работы с эмбрионами. Согласно известному эпидемиологическому положению, именно сочетание факторов, связанных с возбудителем, хозяином и окружающей средой, определяет, будет ли в популяции особей преобладать здоровье или болезнь.¹ Об этом положении важно помнить при обсуждении патогенов эмбрионов. Разработаны три отдельных поколения технологий работы с эмбрионами, и с их появлением возникли серьёзные проблемы.² Каждая технология изменяет условия среды таким образом, что её применение может как усиливать, так и ограничивать распространение инфекционных агентов среди восприимчивого крупного рогатого скота. Поэтому эти технологии необходимо оценивать; такую оценку ежегодно проводит Консультативный комитет по вопросам здоровья и безопасности Международного общества трансплантации эмбрионов (IETS).² Всемирная организация по охране здоровья животных (OIE) принимает предложения комитета относительно стандартов перемещения эмбрионов для минимизации передачи болезней, стандартных протоколов и методов обработки для минимизации связи патогенов с эмбрионами, а также обоснованности экспериментальных методов, применяемых в настоящее время в технологиях работы с эмбрионами для повышения их жизнеспособности и сокращения потерь эмбрионов. При борьбе с патогенами важно учитывать все аспекты, однако профилактика (биобезопасность) лежит в основе предотвращения всех заболеваний.

Первые два поколения — производство эмбрионов, полученных in vivo и in vitro соответственно — широко применяются в товарном скотоводстве и фундаментальных исследованиях. В информационном бюллетене Международного общества трансплантации эмбрионов (http://www.iets.org/pdf/Newsletter/Dec12_IETS_ Newsletter.pdf) сообщалось, что в 2011 г. было проведено 104 651 процедур получения эмбрионов in vivo; в результате всего было собрано 732 862 эмбрионов, из которых 238 194 были трансплантированы свежими, а 309 806 — после замораживания. Для in vitro было получено 453 471 эмбрионов, пригодных для переноса; 373 836 из них перенесли

свежими, а остальные — после замораживания.³ Что касается нынешних показателей по клонированным эмбрионам, данные за 2010 и 2011 не приводились, однако, согласно информационному бюллетеню IETS 2010, в 2009 было выполнено 105 переносов свежих эмбрионов.⁴ Очевидно, это вызывало и продолжает вызывать обоснованное беспокойство: масштабы деятельности внутри стран и на международном уровне могут способствовать широкому распространению любого патогена, который хотя бы изредка передаётся с эмбрионами.

Первое поколение технологий работы с эмбрионами

Получение эмбрионов in vivo можно считать первым поколением технологий работы с эмбрионами. Первые методики были разработаны более 60 лет назад, как подробно описано в обзоре Betteridge.⁵ Сегодня эти базовые процедуры широко применяются в скотоводстве. Они включают стимуляцию суперовуляции у доноров, нехирургическое получение эмбрионов, их криоконсервацию и нехирургический перенос синхронизированным реципиентам.⁶ Широкое внедрение этих репродуктивных методов означало потенциально значимое изменение условий, способное как усилить, так и ослабить распространение местных или заносных патогенов животных.

За последние 30 лет многочисленные патогены крупного рогатого скота изучались в контексте получения эмбрионов in vivo и их переноса, чтобы определить, могут ли эти методы ослаблять или усиливать обычное распространение болезней в популяциях крупного рогатого скота.^7–9 Первоначально предполагалось, что неповреждённая блестящая оболочка защищает ранний зародыш от возбудителей инфекций, а правильное обращение с эмбрионами, имеющими неповреждённую блестящую оболочку, скорее снижает и зачастую устраняет распространение встречающихся в природе патогенов, чем усиливает его. Для проверки этих предположений использовали четыре основных подхода.¹⁰ Сначала эмбрионы с неповреждённой блестящей оболочкой подвергали воздействию in vitro различных патогенов. Их выбирали с учётом связанных с ними ветеринарно-правовых вопросов, например действующих программ борьбы с болезнями внутри страны и/или

действующих ограничений международной торговли. Например, OIE относит блютанг к болезням, о которых необходимо сообщать, ввиду его социально-экономического значения и большой роли международной торговли животными и продукцией животного происхождения.^11,12 Кроме того, для большинства серотипов вируса блютанга (BTV) характерна передача половым путём и через плаценту.^13–17 Поэтому вмешательство человека, препятствующее таким путям передачи или способствующее им, может существенно влиять на распространение BTV,¹⁸ что подчёркивает необходимость этих исследований.

Первый подход состоял в том, что эмбрионы подвергали воздействию изучаемого патогена. После искусственного заражения in vitro эмбрионы промывали с обработкой трипсином или без неё, а затем проверяли на наличие вируса с помощью анализа in vitro либо путём переноса эмбрионов реципиентам, свободным от болезни. За реципиентами и их потомством тщательно наблюдали, выявляя признаки инфекции. Результаты этих опытов были обнадёживающими: применявшиеся процедуры обработки эмбрионов, по-видимому, позволяли предотвращать распространение ряда важных возбудителей инфекций.^19,20 Были проведены и дополнительные исследования, чтобы подтвердить эффективность этих процедур обработки эмбрионов при использовании обычных протоколов их получения и переноса. В этих исследованиях эмбрионы получали от больных доноров — в острой стадии заболевания или в период выздоровления, — промывали или обрабатывали трипсином, а затем либо проверяли на наличие патогенов in vitro либо переносили реципиентам, свободным от болезни. За реципиентами и их потомством наблюдали, чтобы выявить передачу заболевания.^{7–10,19–21} Результаты этих исследований подтвердили, что процедуры обработки эмбрионов, ныне одобренные IETS²¹ и рекомендованные OIE,²² действительно эффективно препятствуют распространению некоторых инфекционных болезней в широком масштабе; OIE относит эти болезни к соответствующим категориям.^8,13,22,23 К таким процедурам относятся стандартные способы обработки эмбрионов, полученных in vivo, перечисленные в руководстве IETS²¹ и одобренные OIE, как уже отмечалось выше.²² В «Руководстве по обучению работе с эмбрионами» Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединённых Наций (FAO)²⁴ приводятся следующие рекомендации.

1. Эмбрионы следует промывать не менее 10 раз, обеспечивая при каждой промывке разведение не менее чем в 100 раз; для переноса эмбрионов между промывками каждый раз следует использовать новую пипетку.

2. Вместе следует промывать только эмбрионы от одного донора, причём за один раз — не более 10 эмбрионов.

3. Иногда, например когда требуется инактивировать или удалить определённые вирусы, такие как герпесвирус крупного рогатого скота (BHV)-1 и вирус болезни Ауески, стандартную процедуру промывки следует дополнить промывками с ферментом трипсином, как описано в руководстве IETS.²¹

4. После промывки всю поверхность блестящей оболочки каждого эмбриона следует осмотреть при увеличении не менее 50 ×, чтобы убедиться в её целостности и отсутствии прилипшего материала.²⁴

Протокол промывки и обработки трипсином при работе с вирусами, способными прикрепляться к эмбрионам, такими как вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (BHV-1), вирус болезни Ауески и вирус везикулярного стоматита, предусматривает пятикратную промывку эмбрионов в

фосфатно-солевом буфере с добавлением антибиотиков и 0.4% бычьего сывороточного альбумина, но без Ca²⁺ и Mg²⁺ (поскольку они подавляют действие трипсина), затем двукратную промывку раствором трипсина продолжительностью 30–45 с каждая и повторную пятикратную промывку солевым раствором с антибиотиками и 2% термически инактивированной сыворотки (а не бычьего сывороточного альбумина) для инактивации трипсина.²⁴ Активность фермента трипсина, используемого для приготовления промывочных растворов, должна быть такой, чтобы 1 g гидролизовал 250 g казеина за 10 мин при 25°C и pH 7.6. Стерильный раствор трипсина должен содержать 0.25% трипсина в сбалансированном солевом растворе Хэнкса без Ca²⁺ и Mg²⁺. В продаже имеются готовые к применению растворы. После промывки всю поверхность эмбрионов следует осмотреть под микроскопом при увеличении не менее 50×.²⁴ Кроме того, в целях борьбы с болезнями переносить или подвергать криоконсервации следует только эмбрионы с неповреждённой блестящей оболочкой, свободной от прилипшего материала.^21–24

Источники патогенов

Хотя некоторым аспектам получения эмбрионов, по-видимому, уделялось достаточно внимания, другие важные источники патогенов при получении эмбрионов изучены недостаточно. К ним относятся загрязнённые материалы (реагенты) животного происхождения и больные реципиенты.^25–27 Понятие «материалы животного происхождения» охватывает различные компоненты, в том числе добавки к питательным средам (например, g фетальную бычью сыворотку или бычий сывороточный альбумин), гормоны, которые могут использоваться для обработки доноров (например, g фолликулостимулирующий гормон гипофизарного происхождения), и ферменты для обработки эмбрионов (например, g трипсин). Подробные описания рисков, связанных с этими продуктами, уже публиковались.^26–28 В частности, бычий сывороточный альбумин маловероятен как источник патогенов, поскольку технология его производства, по-видимому, исключает выживание загрязняющих агентов.^29,30 Напротив, фетальная бычья сыворотка при отсутствии надлежащего контроля качества может быть источником посторонних бактерий, грибов или вирусов.^26,31 Наиболее распространённым загрязняющим агентом в фетальной бычьей сыворотке является вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV).^26,31–33

Известен ряд патогенов, передающихся от матери плоду через плаценту. К ним относятся BVDV, Neospora caninum , BTV, вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV) и Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (болезнь Йоне).^{13–17,34–36} Таким образом, при всесторонней оценке риска всегда следует учитывать всех возбудителей инфекций, способных вызывать временную, латентную или персистирующую инфекцию у донора и/или реципиента, которая может привести к заболеванию плода. В противном случае сбор и перенос эмбрионов, даже свободных от возбудителей, может привести к рождению больного потомства вследствие последующих внутриутробных инфекций.

По состоянию на декабрь 2012 года официальные рекомендации по биобезопасности при международном перемещении эмбрионов изложены в главе 4.7.5 Кодекса здоровья наземных животных в разделе «Управление рисками».³⁷ Эти общие стратегии были разработаны для того, чтобы перенос эмбрионов, полученных in vivo, не приводил к передаче возбудителей инфекций. Существуют три общие стратегии, позволяющие предотвратить передачу возбудителей инфекций при переносе эмбрионов, полученных in vivo, от