Воспроизводство крупного рогатого скота

животных-доноров.^38,39 Каждая из них предполагает искусственное изменение условий среды, призванное препятствовать передаче возбудителей. Для крупного рогатого скота предпочтительным методом является обработка эмбрионов (то есть промывание или обработка трипсином),²¹ как описано выше, поскольку она относительно недорога, а её способность предотвращать распространение различных вирусов, бактерий и губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота подтверждена многочисленными исследованиями (см. таблицу 80.1).^8,22,37–39

Для крупного рогатого скота применяли и другие методы, включая обследование доноров, а также карантин и обследование реципиентов.³⁸ Обследование доноров на наличие заболевания во время сбора эмбрионов, а затем повторно через несколько недель или месяцев (пока эмбрионы хранятся в криоконсервированном состоянии) позволяет подтвердить, что доноры не являются возможным источником возбудителя. Обследование реципиентов после переноса эмбрионов и потомства после рождения служит биопробой: реципиенты и потомство выступают в роли животных-индикаторов. Однако для этого требуется длительный карантин животных. Кроме того, эти методы дорогостоящи и требуют проведения нескольких анализов, если необходимо выявить более одного заболевания, а также убедиться, что во время карантина не произошло случайного заражения. Поэтому с экономической точки зрения обработка эмбрионов является предпочтительным методом подтверждения их благополучия в отношении инфекций. Этот метод значительно облегчил международную торговлю эмбрионами благодаря преимуществам с точки зрения благополучия животных, борьбы с болезнями и экономики.³⁸

Категоризация возбудителей заболеваний, связанных с эмбрионами

Чтобы ещё больше облегчить международную торговлю эмбрионами, OIE при содействии подкомитета IETS по исследованиям в области охраны здоровья и безопасности составляет оценку, или категоризацию, известного риска передачи конкретного заболевания при переносе эмбрионов и ежегодно её обновляет.^22,23 Официальная категоризация заболеваний, связанных с эмбрионами, подробнее изложена в главе 1.4.7.14 Кодекса здоровья наземных животных в разделе «Категоризация болезней и патогенных агентов».²² Болезни категории 1 определены и перечислены в таблице 80.1.

В Кодексе здоровья наземных животных 1.4.7.14 указано, что к категории 2 относятся болезни, для которых накоплены убедительные данные о пренебрежимо малом риске передачи при условии надлежащего обращения с эмбрионами в период между сбором и переносом согласно Руководству IETS, но для подтверждения имеющихся данных требуются дополнительные переносы эмбрионов.²² К категории 2 относятся следующие болезни: блютанг (овцы), артрит-энцефалит коз и классическая чума свиней. К категории 3 относятся болезни или патогенные агенты, для которых предварительные данные указывают на пренебрежимо малый риск передачи при условии надлежащего обращения с эмбрионами в период между сбором и переносом согласно Руководству IETS, но для подтверждения предварительных результатов необходимы дополнительные данные экспериментов in vitro и in vivo.²² К категории 3 относятся следующие болезни или патогенные агенты: вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (козы), BVDV (крупный рогатый скот), Campylobacter fetus (овцы), ящур (свиньи, овцы и козы), Haemophilus somnus (крупный рогатый скот), маэди-висна

Таблица 80.1 Болезни или патогенные агенты категории 1, для которых имеется достаточно исследований, показывающих, что риск передачи при переносе эмбрионов, полученных in vivo, пренебрежимо мал при условии надлежащего обращения с эмбрионами в период между сбором и переносом.

Источник : глава 4.7.14 Кодекса здоровья наземных животных (http://www.oie.int/index. php?id=169&L=0&htmfile=chapitre_1.4.7.htm).

(овцы), Mycobacterium paratuberculosis (крупный рогатый скот), Neospora caninum (крупный рогатый скот), легочный аденоматоз овец, репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS), чума крупного рогатого скота (ликвидирована) и везикулярная болезнь свиней.²² К категории 4 согласно Кодексу здоровья наземных животных 1.4.7.14 относятся болезни и патогенные агенты, в отношении которых проведены или проводятся исследования, пока не позволяющие сделать вывод об уровне риска передачи, либо указывающие на то, что риск передачи при пересадке эмбрионов может быть существенным, даже если в период между получением и пересадкой с эмбрионами обращаются надлежащим образом в соответствии с руководством IETS.²² К категории 4 относятся следующие болезни и патогенные агенты: африканская чума свиней, болезнь Акабане (крупный рогатый скот), анаплазмоз крупного рогатого скота, катаральная лихорадка овец (козы), пограничная болезнь (овцы), BHV-4, Chlamydia psittaci (крупный рогатый скот, овцы), контагиозный метрит лошадей, энтеровирус (крупный рогатый скот, свиньи), ринопневмония лошадей, вирусный артериит лошадей, Escherichia coli 09:K99 (крупный рогатый скот), Leptospira borgpetersenii серовар Hardjobovis (крупный рогатый скот), Leptospira sp. (свиньи), нодулярный дерматит крупного рогатого скота, Mycobacterium bovis (крупный рогатый скот), Mycoplasma spp. (свиньи), эпидидимит овец ( Brucella ovis ), вирус парагриппа-3 (крупный рогатый скот), парвовирус (свиньи), цирковирус свиней (тип 2) (свиньи), скрепи (козы), Tritrichomonas foetus (крупный рогатый скот), Ureaplasma и Mycoplasma spp. (крупный рогатый скот, козы), а также везикулярный стоматит (крупный рогатый скот, свиньи).²²

Борьба с вирусными патогенами

Ограниченный объём главы не позволяет обсудить каждую болезнь из всех четырёх категорий. Поэтому далее в этой главе основное внимание будет уделено BVDV. Этот вирус имеет огромное значение из-за колоссального экономического ущерба, который он наносит мясному и молочному скотоводству: он снижает продуктивность вследствие ухудшения эффективности использования корма и сокращения выработки молока, а также вызывает гибель эмбрионов на ранних стадиях развития, аборты, мумификацию плодов, аномалии развития плодов, пневмонию и различные другие заболевания, ослабляющие животных.^28,40–47 Экономический ущерб от BVDV оценивался в исследовании Houe,⁴¹ согласно которому потери скотоводческой отрасли от BVDV составляли

20–57 миллионов долларов на миллион отёлов. Недавно Hessman и соавт.⁴² исследовали экономические последствия, а также здоровье и продуктивность поголовья крупного рогатого скота после контакта с персистентно инфицированными (PI) животными. Они сообщили, что среди животных, непосредственно контактировавших с PI-животным, экономические потери вследствие гибели составляли 5.26 долларов на животное, а потери из-за снижения продуктивности были значительно выше — 88.26 долларов на животное. Кроме того, ввиду значительного экономического ущерба от инфекций, вызываемых BVDV, ряд стран, в том числе Дания, Финляндия, Норвегия, Швеция, Шетландские острова и Словения, разработали программы ликвидации этой инфекции.^28,48–52 В нескольких странах действуют программы борьбы с инфекцией и ведётся подготовка к внедрению программ её ликвидации. В других странах, например в США, установление стандартов борьбы с BVDV путём создания добровольных программ предоставлено отдельным штатам и, прежде всего, работающим в них животноводам. Борьбу с BVDV в США дополнительно осложняет присутствие вируса в популяции белохвостых оленей.^53,54 Поэтому большинство программ борьбы с инфекцией сосредоточено на надлежащих мерах биобезопасности, включая карантин, тестирование, выявление и удаление PI-животных, а также предотвращение появления новых PI-животных.

Пересадка эмбрионов как средство предотвращения передачи патогенов

Исторически пересадку эмбрионов применяли как способ свести к минимуму передачу болезней и одновременно максимально использовать генетический потенциал животных.^55,56 Однако после начала применения этого метода возникли вопросы о способности эмбрионов передавать патогены. Многочисленные исследования показали, что пересадка эмбрионов действительно позволяет предотвращать или сводить к минимуму передачу патогенов при условии надлежащего контроля качества и соблюдения соответствующих процедур обработки.^{8,38,39,55–61} Однако для некоторых микроорганизмов предотвращение передачи патогенов не было бесспорно доказано, а в отдельных случаях пересадка эмбрионов, вероятно, могла служить механизмом заноса болезни. Первоначальное отнесение BVDV к категории 3 основывалось на исследовании, проведённом более 20 лет назад.⁵⁶ Это исследование подтвердило эффективность промывания эмбрионов для удаления вируса после искусственного заражения эмбрионов цитопатогенным изолятом BVDV.⁵⁶ В ходе четырёх более поздних исследований после пересадки промытых или обработанных трипсином эмбрионов, полученных от PI-коров-доноров, в общей сложности родилось пять телят, свободных от BVDV.^57–60 Хотя данные этих четырёх публикаций были ограниченными, результаты обнадёживали. Однако сообщения Lindberg и соавт.⁶² и Drew и соавт.⁶³ побудили продолжить изучение возможности передачи BVDV при пересадке эмбрионов: в первом случае после пересадки эмбрионов у тёлок произошла сероконверсия, а во втором после пересадки эмбриона родился PI-телёнок. Предполагалось, что причиной этих инфекций стала загрязнённая сыворотка крови плодов крупного рогатого скота. Поэтому потребовались дополнительные исследования, чтобы установить, сохраняется ли BVDV на эмбрионах после стандартной обработки эмбрионов, полученных in vivo и проводимой по правилам IETS, и может ли связанный с эмбрионами вирус передаваться при их пересадке. Дальнейшие исследования показали, что разные штаммы BVDV различаются по степени сродства к эмбрионам.^64,65 Было показано, что некоторые штаммы сохраняли связь с эмбрионами после обработки по процедурам IETS

в том числе при добавлении к этим процедурам обработки трипсином.^64,65 Эти штаммы с высоким сродством стали вызывать ещё большее беспокойство, когда было установлено, что связанный с эмбрионами вирус действительно заразен как в исследованиях in vitro, так и в исследованиях in vivo.^65,66 В недавнем исследовании Gard и соавт.⁶⁷ сообщили, что у 27% эмбрионов, полученных in vivo, и у 42% эмбрионов, полученных in vitro, после искусственного воздействия штамма BVDV с высоким сродством (SD-1, тип 1a) и промывания в соответствии с процедурами IETS (без трипсина) обнаруживался связанный с эмбрионами вирус (EAV). Было также установлено, что количество EAV составляло от 100 до 450 CCID50 (инфицирующих доз для клеточной культуры при конечной точке 50%) на эмбрион.⁶⁷ В предыдущих исследованиях также было установлено, что EAV сохраняет инфекционность в системе культивирования in vitro и в модели in vivo при внутривенном введении эмбрионов реципиентам, у которых не обнаруживались вирус и антитела к нему.^64,66,67 Недавно было проведено дополнительное исследование, в котором использовали удвоенное количество EAV по сравнению с ранее выявленным у отдельных эмбрионов, полученных in vivo и in vitro, после процедур обработки.⁶⁸ Затем это количество удвоили (878 CCID50 на соломинку), чтобы воспроизвести практику, иногда применяемую при пересадке эмбрионов, а именно одновременную пересадку двух эмбрионов одному реципиенту, и учесть наихудший сценарий. Было установлено, что у всех реципиентов, получивших эмбрионы и вирус, развилась виремия, а затем произошла сероконверсия. На 30-й день после пересадки было выявлено шесть случаев беременности, а на 60-й день — только один. Однако все беременности прервались. При беременности на сроке 60 дней плод извлекли посредством кольпотомии и исследовали на BVDV. Секвенирование показало, что выявленный штамм BVDV — SD-1, то есть тот же штамм, которым проводили заражение.⁶⁸ Отсутствие в этом исследовании потомства, положительного по BVDV, согласуется с результатами Bielanski и соавт.⁶⁹ В их исследовании эмбрионы, полученные in vitro, подвергали воздействию нецитопатических биотипов BVDV в течение 1 часа: штамма типа 2 (P-131) или штамма типа 1 (NY-1). Затем эмбрионы промывали в соответствии с рекомендациями IETS (без обработки трипсином) и пересаживали серонегативным и BVDV-отрицательным реципиентам. После внутриматочной пересадки эмбрионов сероконверсии не произошло ни у одного из реципиентов, получивших эмбрионы, подвергнутые воздействию штамма типа 1. Однако из 35 реципиентов, получивших эмбрионы, подвергнутые воздействию штамма типа 2, сероконверсия произошла у 18 (51%); на 30-й день после пересадки было выявлено 11 случаев беременности, но лишь в двух случаях родилось живое потомство. У обоих родившихся животных не обнаружили ни BVDV, ни антител к нему.⁶⁹ Таким образом, по-видимому, иммунная система плода не распознала инфекцию и/или вирус был уничтожен до формирования иммунной компетентности, поэтому антитела у плода не выработались. Отсутствие выявляемой сероконверсии при воздействии штамма типа 1 и аборты, вызванные BVDV типа 2, могут быть следствием мутаций вируса. В исследовании Meyers и соавт. ,⁷⁰ при введении беременным коровам двух различных мутантных штаммов вируса не наблюдались снижение выработки интерферона, аборты или присутствие вируса в тканях плодов. Каждый из этих мутантных штаммов имел мутации, затрагивавшие N-концевую протеазу (N(pro)), а также делецию кодона 349, которая устраняет РНКазную активность структурного гликопротеина E(rns). Однако при заражении вирусами дикого типа и вирусами, имевшими только одну из мутаций — в N(pro) либо в E(rns), — наблюдались снижение выработки интерферона, аборты и присутствие вируса в тканях плодов.⁷⁰ Следовательно, для формирования персистирующей инфекции необходимы как N(pro), так и E(rns). Логично предположить, что

штамм типа 1, использованный в исследовании Bielanski, мог иметь мутации в этих участках, благодаря чему выработка интерферона была достаточной и заражения плода не произошло. Разные штаммы могут по-разному влиять на выработку интерферона и, следовательно, могут вызывать или не вызывать заражение плода, причём такое заражение может быть смертельным для плода, а может и не быть.

С учётом результатов этих исследований и разнообразия штаммов BVDV нельзя исключать появления животного с персистирующей инфекцией (PI) вследствие пересадки заражённого эмбриона. Результаты исследований Gard и Bielanski показывают, что некоторые изоляты с высоким сродством могут вызывать виремию и сероконверсию у восприимчивых реципиентов с последующей гибелью эмбрионов на ранней стадии и абортами.^68,69 Однако, судя по результатам этих недавних исследований, появление животного с PI после пересадки заражённых эмбрионов, по-видимому, с большей вероятностью связано с виремией у реципиента (острым заражением) и выделением вируса, заражающего других беременных животных, чем с самой пересадкой заражённого эмбриона. Тем не менее необходимо провести дополнительные исследования с использованием эмбрионов, естественным образом заражённых различными штаммами BVDV и пересаженных в матку, чтобы установить способность BVDV передаваться внутриутробно и оценить вероятность рождения телёнка с PI. Тщательная оценка важна, поскольку возможность передачи BVDV через эмбрион потребовала бы пересмотра процедур подтверждения здоровья эмбрионов, а также введения дополнительных правил в отношении эмбрионов, экспортируемых из стран, где присутствует BVDV, в страны, где этот вирус искоренён.

Второе поколение технологий получения эмбрионов

Получение эмбрионов in vitro называют вторым поколением технологий получения эмбрионов; большинство основных элементов этого процесса для крупного рогатого скота были разработаны и усовершенствованы за последние 35 лет.^28,39,71 Основные процедуры, используемые в настоящее время при получении эмбрионов in vitro, включают получение ооцитов путём трансвагинальной аспирации фолликулов, созревание ооцитов in vitro (IVM), капацитацию сперматозоидов in vitro, оплодотворение in vitro (IVF), культивирование эмбрионов in vitro (IVC) до стадии бластоцисты и пересадку эмбриона реципиенту.⁷² Эта технология предполагает множество изменений условий разведения животных и создаёт возможности для проникновения, размножения и распространения патогенов. Поэтому существует ряд возможных источников патогенов при получении эмбрионов in vitro. К ним относятся гаметы и связанные с ними жидкости, соматические клетки, используемые при IVM, IVF или IVC, а также материалы животного происхождения, добавляемые в среды для созревания, оплодотворения или культивирования (например, g, сыворотка крови плодов крупного рогатого скота, бычий сывороточный альбумин или фолликулостимулирующий гормон).²⁶

Исследования на наличие загрязняющих агентов в лабораториях по получению эмбрионов in vitro проводились в ряде стран, в том числе в Канаде,^73,74 Дании,⁷⁵ Франции^7,76 и США.^71,77,78Как и ожидалось, при использовании материалов, полученных на бойне, в системах получения эмбрионов уровень бактериального загрязнения может быть довольно высоким: от 13 до 68% образцовin vitro.⁷¹Кроме того, в материалах, полученных на бойне, обнаруживали BVDV и BHV-1 в небольшом или умеренном количестве: положительный результат на BVDV давали 1–12% образцов, а на BHV-1 — 0–12% образцов.^71,78

Поскольку BVDV широко распространён среди крупного рогатого скота и, как известно, поражает репродуктивные ткани, исследователи уделяют ему больше всего внимания.⁷⁷Было показано, что все материалы животного происхождения, используемые при получении эмбрионов крупного рогатого скота методом ЭКО (продукты животного происхождения, яичники, ооциты, фолликулярная жидкость, клетки кумулюса, клетки маточных труб и сыворотка), содержат BVDV, если их получают от животных с активной инфекцией.^77,79Опасность усугубляется тем, что у части животных, инфицированных BVDV, симптомы отсутствуют.^41,80У крупного рогатого скота с персистирующей инфекцией BVDV симптомы часто отсутствуют; такие животные служат резервуаром большого количества вируса.⁴¹Кроме того, большинство полевых изолятов BVDV не обладают цитопатическим действием и могут вызывать незаметную персистирующую инфекцию в устойчивых лабораторных клеточных линиях,^31,79которые используют для совместного культивирования с эмбрионами.^31,79Наконец, следует отметить, что условия культивирования на каждом этапе получения эмбрионов методом ЭКО идеально подходят для размножения BVDV: вирусу доступны достаточное время, питательная среда и восприимчивые клетки. Поэтому даже низкий уровень загрязнения может привести к значительному размножению вируса, в результате чего к концу культивирования in vitro эмбрионы подвергаются воздействию высокой концентрации вируса.

Как и в случае эмбрионов, полученных in vivo, первоначально предполагалось, что прозрачная оболочка эмбрионов, полученных методом ЭКО, защитит развивающийся зародыш от инфекций. Исследования с искусственным заражением действительно показали, что неповреждённая прозрачная оболочка служит эффективным барьером, через который возбудители проникают редко.⁸¹Тем не менее ясно, что процедуры обработки, рекомендованные для эмбрионов, полученных in vivo, менее эффективны для эмбрионов, полученных методом ЭКО, поскольку было показано, что ряд возбудителей (например, g BTV, BHV-1, вирус ящура и BVDV) легче прикрепляется к прозрачной оболочке таких эмбрионов.^77,78Кроме того, было показано, что присутствие вируса снижает частоту созревания, оплодотворения и развития эмбрионов.^77,82–85

Исследования показали, что BVDV остаётся связанным с эмбрионами, полученными in vitro, после воздействия вируса и последующего промывания или обработки трипсином.^86,87Однако заражение восприимчивых реципиентов после переноса подвергшихся воздействию вируса эмбрионов продемонстрировано не было. Кроме того, при попытках установить, составляет ли количество BVDV, связанного с отдельными эмбрионами, инфекционную дозу in utero .^88,89были получены некоторые интересные результаты. Совокупные результаты исследований риска передачи BVDV при переносе эмбрионов, полученных in vitro, несколько противоречивы. С одной стороны, ясно, что несколько штаммов BVDV остаются связанными с эмбрионами, полученными методом ЭКО, после промывания или обработки трипсином.^88–90С другой стороны, по-видимому, существуют естественные факторы, препятствующие передаче связанного с эмбрионами вируса восприимчивым клеткам in vitro .^88–90. Очевидно, что для разрешения этих вопросов необходимы дальнейшие исследования.

Официальные рекомендации по международной перевозкеin vitro — эмбрионов, полученных этим методом, для предотвращения распространения болезней изложены в главе 4.8 Кодекса здоровья наземных животных МЭБ.⁹¹ Препятствиями для введения общепризнанных санитарных мер при получении эмбрионов крупного рогатого скота методом ЭКО являются различия в методиках разных лабораторий, сравнительная лёгкость, с которой возбудители прикрепляются к прозрачной оболочке, а также то, что исходный материал часто получают на бойнях.⁹² Очевидно, что механическая промывка и обработка трипсином эмбрионов, полученных методом ЭКО,^86,87 не обеспечивают такой же