Воспроизводство крупного рогатого скота

среди эмбрионов, полученных in vitro. Theriogenology 1998; 50:769–777.

1. Vanroose G, Nanwynek H, Vansoom A, Vanopdenbosch E, DeKruif A. Влияние герпесвируса крупного рогатого скота-1 и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота на развитие эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro. Mol Reprod Dev 1999;54:255–263.

2. Dinkin M, Stallknecht D, Brackett B. Снижение инфекционности вируса эпизоотической геморрагической болезни, связанного с эмбрионами крупного рогатого скота, полученными in vitro, с помощью неспецифической протеазы. Anim Reprod Sci 2001;65:205–213.

3. Bielanski A, Jordan L. Промывание, как и промывание с последующей обработкой трипсином, неэффективно для удаления нецитопатогенного вируса вирусной диареи крупного рогатого скота из яйцеклеток или эмбрионов крупного рогатого скота после экспериментального заражения вирусом системы оплодотворения in vitro. Theriogenology 1996;46:1467–1476.

4. Trachte E, Stringfellow DA, Riddell KP, Galik PK, Riddell MG, Wright J. Промывание и обработка трипсином эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro и подвергнутых воздействию вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Theriogenology 1998;50:717–726.

5. Givens M, Galik P, Riddell K, Brock K, Stringfellow D. Количество и инфекционность вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, связанного с эмбрионами, и противовирусное действие бластоцисты препятствуют инфицированию клеток маточной трубы in vitro. Theriogenology 1999;52:887–900.

6. Givens M, Galik P, Riddell K, Stringfellow D. Клетки маточной трубы остаются неинфицированными после культивирования с эмбрионами, полученными in vitro и подвергнутыми воздействию вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Vet Microbiol 1999;70:7–20.

7. Givens M, Galik P, Riddell K, Brock K, Stringfellow D. Репликация и персистенция различных штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота в системе получения эмбрионов in vitro. Theriogenology 2000;54:1093–1107.

8. Без указания автора. Кодекс здоровья наземных животных, глава 4.8. www. oie.int/index.php?id=169&L=0&htmfile=chapitre_1.4.8.htm.

9. Nibart M, Marquant-Le Guienne B, Humbolt P. Общие санитарные процедуры при получении эмбрионов in vitro. В кн.: Stringfellow DA, Seidel SM (ред.) Руководство Международного общества трансплантации эмбрионов , 3-е изд. Савой, штат Иллинойс: Международное общество по трансплантации эмбрионов, 1998, с. 67–77.

10. Edens M, Galik P, Riddell K, Givens M, Stringfellow D, Loskutoff N. Герпесвирус крупного рогатого скота -1, связанный с отдельными эмбрионами, обработанными трипсином, не был заразен для клеток маточных труб. Theriogenology 2003;60:1495–1504.

11. Shin T, Sneed L, Hill J, Westhusin M. Высокая частота нарушений развития у плодов крупного рогатого скота, полученных путём клонирования клеток, инфицированных вирусом вирусной диареи крупного рогатого скота. Theriogenology 2000;53;243.

12. Stringfellow D, Riddell K, Givens M и др. Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV) в клеточных линиях, используемых для клонирования соматических клеток. Theriogenology 2005;63:1004–1013.

13. Givens M, Marley M. Инфекционные причины гибели эмбрионов и плодов. Theriogenology 2008;3:270–285.

14. Galik P, Gard J, Givens M и др. Влияние овечьего интерферона-тау на репликацию вируса вирусной диареи крупного рогатого скота и герпесвируса крупного рогатого скота -1. Reprod Fertil Dev 2007;20:156–157.

15. Givens M, Stringfellow D, Riddell K и др. Здоровые телята, полученные после переноса эмбрионов, оплодотворённых in vitro и культивированных в присутствии противовирусного соединения. Theriogenology 2006;65:344–355.

16. Givens M, Stringfellow D, Dykstra C и др. Профилактика и устранение инфекций, вызванных вирусом вирусной диареи крупного рогатого скота, в фибробластах плода. Antiviral Res 2004;64:113–118.

17. Newcomer B, Marley M, Ridpath J и др. Эффективность противовирусного соединения в подавлении репликации нескольких видов пестивирусов Antiviral Res 2012;96:127–129.

18. Walker A, Kimura K, Roberts R. Экспрессия вариантов бычьего интерферона-тау в зависимости от пола и возраста зародышей. Theriogenology 2009;72:44–53.

Глава 81

Экстракорпоральное оплодотворение

Джон Ф. Хаслер¹ и Дженнифер П. Барфилд²

1 Bioniche Animal Health, Inc., Лапорт, Колорадо, США

2 Кафедра биомедицинских наук, Лаборатория репродукции животных и биотехнологии, Университет штата Колорадо, Форт-Коллинс, Колорадо, США

Введение

На латыни in vitro означает «в стекле», а экстракорпоральное оплодотворение (IVF) часто служит общим названием процесса получения эмбрионов вне организма, который также включает экстракорпоральное созревание (IVM) и экстракорпоральное культивирование (IVC). Эти процедуры проводят последовательно — IVM–IVF–IVC — для получения эмбрионов исключительно in vitro (IVP).

В 1959 году кролик стал первым видом млекопитающих, у которого с помощью IVF удалось получить живое потомство,¹ а в 1968 году таким видом стали лабораторные мыши.² Поскольку мышь не подходила в качестве модели для крупного рогатого скота, первый успешный опыт IVF у крупного рогатого скота был проведён в 1977 году, когда сперматозоиды подвергли капацитации в яйцеводе или матке коровы либо крольчихи,³ а первый живой телёнок родился в 1981 году после переноса 4-клеточного эмбриона в яйцевод коровы-реципиента.⁴ Первые телята, полученные полностью с помощью IVM, IVF и IVC, родились в 1987 году.⁵ С тех пор исследования методов in vitro получили значительное развитие. Кроме того, методы in vitro теперь применяются в коммерческой практике совместно с переносом эмбрионов в ряде стран. В этой главе мы намерены описать наиболее современные методы получения ооцитов, получения эмбрионов in vitro и использования таких эмбрионов в скотоводстве. Некоторые области применения технологии IVF у крупного рогатого скота перечислены в таблице 81.1.

Получение ооцитов

Первоначально, in vitroПроцедуры in vitro у крупного рогатого скота первоначально проводили главным образом в исследовательских целях, используя ооциты, полученные от самок после стимуляции суперовуляции. При сборе из преовуляторных фолликулов или яйцеводов через 20–24 часов после начала течки ооциты уже прошли созревание и готовы к IVF и IVC. Ооцитам, полученным из яичников с боен, требуется IVM, поэтому исследования с их использованием отставали до усовершенствования методов IVM. Сегодня яичники крупного рогатого скота с боен широко используются как источник ооцитов.

Получение ооцитов от живого крупного рогатого скота

Основной метод получения ооцитов от живого крупного рогатого скота — аспирация из яичников, положение которых регулируют через прямую кишку, под контролем введённых во влагалище ультразвукового датчика и иглы. До разработки этого метода ооциты получали хирургическим путём через разрез в боку⁶ или при лапароскопических вмешательствах через поясничную ямку,⁷ однако такие подходы были дорогостоящими и малоэффективными, а также создавали риск образования спаек с последующей потерей плодовитости. Внедрение трансректальной ультразвуковой визуализации в реальном времени (обзор см. в источнике 8) привело к разработке методов многократного получения ооцитов от самок крупного рогатого скота. Получение ооцитов через поясничную ямку под ультразвуковым контролем было описано в 1987 году Каллесеном и соавт.⁹ а первый эффективный метод, допускающий многократное применение и предусматривающий трансвагинальную аспирацию под ультразвуковым контролем, был разработан в 1988 году.¹⁰ Этот метод получил широкую известность как извлечение яйцеклеток (OPU), или трансвагинальная аспирация. Ультразвуковой датчик с прикреплённым к нему направителем иглы, применяемый у крупного рогатого скота, показан на рисунке 81.1. Там же приведена схема введения датчика в свод влагалища, позволяющего направить иглу через стенку влагалища в яичник.

Количество ооцитов, получаемых от коровы за один сеанс OPU, зависит от множества факторов. Из механических факторов на количество полученных неповреждённых комплексов «кумулюс — ооцит» влияют разрежение, используемое для извлечения ооцита из фолликула, диаметр иглы,¹² а также длина её скоса.¹³ Ещё один фактор — частота получения ооцитов. OPU можно проводить у одной и той же коровы один или два раза в неделю без применения экзогенных гормонов. Исследования не выявили преимуществ какого-либо интервала между процедурами по числу ооцитов, полученных за один сеанс, при сравнении интервалов в 3, 4 и 7 дней.^14–16 Конечная цель — получение эмбрионов, пригодных для переноса реципиентам; с этой точки зрения имеются данные, что интервал в 3 или 4 дней (8 ооцитов за один сеанс OPU) лучше интервала в 7 дней (5.5 ооцитов за один сеанс OPU).¹⁷

Таблица 81.1 Области применения технологии IVF.

(b)

(a)

Рисунок 81.1 (а) Ультразвуковой датчик с иглой для аспирации ооцитов, выступающей из направителя иглы. (б) Схема расположения ультразвукового датчика, прижатого к своду влагалища; положение яичника регулируют рукой через прямую кишку и удерживают его у стенки влагалища. Воспроизведено с разрешения Хаслера.¹¹

Количество ооцитов, получаемых за один сеанс OPU, можно увеличить предварительным введением донору гонадотропинов.^18,19В весьма обстоятельном исследовании, в котором сравнивались различные интервалы между процедурами OPU с применением фолликулостимулирующего гормона (FSH) и без него, Chaubal и соавт.²⁰ сообщили, что наиболее продуктивный протокол по выходу ооцитов и эмбрионов включал удаление доминантного фолликула, введение FSH через 36 часов и проведение OPU через 48 часов после введения FSH. Эту схему чередовали по неделям с однократным проведением OPU без стимуляции. При еженедельном проведении OPU с применением FSH получали в среднем 10.6 ооцитов и 2.4 бластоцист, а при чередовавшемся с ним еженедельном проведении OPU без FSH — в среднем 4.6 ооцитов и 0.9 бластоцист. Взаимодействие факторов, в том числе частоты проведения OPU и применения либо отсутствия стимуляции FSH, недавно было рассмотрено в обзорной работе.²¹

Порода крупного рогатого скота также имеет большое значение. Низкое среднее количество пригодных к использованию ооцитов — от 4.1 до 5.3 — отмечали Hasler и соавт.²² и Looney и соавт.²³ в смешанных группах животных молочных и мясных пород, включавших коров старшего возраста с различными нарушениями фертильности. Применение FSH с последующим периодом без гормональной стимуляции сейчас успешно практикуется несколькими коммерческими предприятиями Северной Америки, занимающимися получением эмбрионов крупного рогатого скота in vitro; это позволяет получать в среднем около 20 ооцитов у животных Bos taurus раз в 2 недель (данные предоставлены Trans Ova Genetics). В Южной Америке (преимущественно в Бразилии) у скота породы нелоре обычно получают 17–25 ооцитов без предварительной стимуляции FSH. Нелоре — местная порода брахманского происхождения, у которой в ходе каждой фолликулярной волны, как известно, развивается больше фолликулов, чем у самок Bos indicus (данные предоставлены In Vitro Brazil).

Возраст донора также может влиять на количество ооцитов, получаемых за одну процедуру OPU. Данные по коровам голштинской породы свидетельствуют о том, что

у коров в возрасте 6–9 лет можно получать значительно больше ооцитов, чем у коров в возрасте 14–18 лет.¹⁶ Однако в основном это были животные, которым проводили OPU/IVP из-за ранее возникших нарушений фертильности. Недавно полученные неопубликованные данные крупного коммерческого in vitro в программе с участием доноров со здоровой репродуктивной системой показала, что число полученных ооцитов мало менялось до возраста 13 лет, а затем неуклонно снижалось с 14 до 18 лет (данные предоставлены Trans Ova Genetics). Примечательно, что в этой программе потенциал развития ооцитов был сходным во всех возрастных группах доноров.

Число ооцитов, получаемых от разных доноров за определённый период, значительно варьирует. Например, от 8-летней коровы голштинской породы, ранее признанной бесплодной, за 167 недель при 167 сборах ооцитов получили в общей сложности 176 эмбрионов от 23 разных быков-производителей.¹⁶ При повторных сборах методом OPU среднее число ооцитов снижалось, однако потенциал развития ооцитов, полученных методом OPU, не менялся. Это наглядно демонстрирует возможность получения большого числа эмбрионов методами OPU–IVP, а также преимущество, заключающееся в возможности использовать разных быков-производителей каждую неделю или даже раз в две недели.

Сбор ооцитов из удалённых яичников

Помимо получения ооцитов у крупного рогатого скота методом OPU, существует несколько ситуаций, в которых ооциты извлекают из удалённых яичников. При развитии у коров смертельных заболеваний или тяжёлой хромоты яичники можно удалить посредством боковой