Воспроизводство крупного рогатого скота

лапаротомии или через разрез влагалища, а ооциты извлечь путём аспирации содержимого фолликулов или разрезания яичников. Stringfellow и соавт.²⁴ сообщили, что при разрезании коркового слоя яичников от 18 выбракованных молочных коров получали в среднем 46 ооцитов. В рамках весьма успешной коммерческой программы Green и McGuirk²⁵ сообщили, что в более чем 100 случаях от коров с хроническими заболеваниями, травмами и старческими изменениями получали в среднем 46 ооцитов и девять эмбрионов на одного донора.

Сбор ооцитов из яичников, полученных на бойне

Крупным источником ооцитов служат яичники коров, забитых на бойнях. Содержимое всех фолликулов диаметром от 3 до 8 mm аспирируют, а собранные ооциты используют для получения эмбрионов методом IVP. В системе массового производства с использованием яичников, полученных на бойне, Lu и Polge²⁶ сообщили о получении более 200 000 бластоцист in vitro из приблизительно 700 000 ооцитов за 2 лет. Хотя эта программа уже не действует, она продемонстрировала возможность получения эмбрионов методом IVP после убоя крупного рогатого скота. Согласно сообщениям, из одной пары яичников иногда можно извлечь 100 и даже 200 ооцитов Bos taurus яичников.²⁶В Японии яичники отдельных коров Коби получают при убое и отправляют в лабораторию для получения эмбрионов in vitro. Позднее в тот же день по стоимости туш животных с установленными индивидуальными номерами определяют, какие ооциты сохранить и провести через все этапы процедуры получения эмбрионов in vitro. Помимо коммерческого применения, эмбрионы in vitro получают в университетах и лабораториях по всему миру как ценный материал для исследований репродукции крупного рогатого скота.²⁷

Питательные среды

После сбора ооциты последовательно культивируют в нескольких средах, обеспечивающих созревание in vitro (IVM), оплодотворение in vitro (IVF) и развитие in vitro. Как правило, для получения эмбрионов in vitro используют не менее шести различных сред. Большинство этих сред не выпускается промышленно, и их необходимо готовить в лаборатории, хотя некоторые коммерческие системы сред существуют. Все эти среды содержат общие компоненты, которые кратко рассмотрены ниже; затем описаны особенности сред, используемых на отдельных стадиях развития.

Вода

Чистая вода — основной по количеству компонент всех сред, используемых при любых процедурах работы с эмбрионами. Более того, качество воды можно считать важнейшим фактором, определяющим качество сред для эмбрионов. Вопросы о том, какую воду считать чистой и как лучше всего её получать, подробно рассмотрены в литературе.²⁸

Соли

Для приготовления практически всех сред, используемых при получении эмбрионов in vitro, применяют различные соли, в том числе хлорид натрия и фосфат калия. Эти компоненты, как и все химические вещества, используемые для приготовления сред, должны быть реактивами

соответствующей степени чистоты и по возможности иметь подтверждение того, что они «прошли испытания на эмбрионах мышей».

Источники энергии

В качестве источников энергии в состав сред часто включают глюкозу, фруктозу и/или пируват. Установлено, что на ранних стадиях развития эмбрионов крупного рогатого скота оптимальная концентрация глюкозы должна быть низкой — около 0.5 mmol/L. Однако после достижения стадии поздней морулы желательна более высокая концентрация глюкозы, и большинство сред для переноса эмбрионов содержат примерно 2.0 mmol/L глюкозы.

Макромолекулы

К макромолекулам относятся сыворотка, бычий сывороточный альбумин (BSA), гиалуроновая кислота и синтетические вещества, такие как поливиниловый спирт. Важнейшая причина включения макромолекул в среды для получения эмбрионов in vitro — их поверхностно-активные свойства, благодаря которым снижается вероятность того, что эмбрионы будут всплывать или прилипать к оборудованию, наконечникам пипеток, соломинкам и чашкам Петри. В частности, сыворотка содержит широкий спектр компонентов, полезных для развития эмбрионов, включая белки, факторы роста, витамины, минеральные вещества и энергетические субстраты; установлено, что сыворотка способствует развитию бластоцист.²⁹ Сыворотка и BSA также обеспечивают ряд физико-химических свойств среды, в том числе хелатирование, регуляцию коллоидно-осмотического давления и pH. К сожалению, добавление сыворотки при культивировании in vitro (IVC) связано с высокой частотой патологий беременности и развития потомства, часто называемых синдромом крупного потомства.^30–33

Поливиниловый спирт используют главным образом как поверхностно-активное вещество в средах для вымывания и хранения эмбрионов, состав которых не включает компонентов животного происхождения. Эти среды применялись при работе с сотнями тысяч коров-доноров и дали весьма удовлетворительные результаты, о чём свидетельствуют многочисленные повторные продажи и устные отзывы большого числа специалистов по переносу эмбрионов крупного рогатого скота и лошадей (неопубликованные данные предоставлены компанией Bioniche Animal Health, Inc.).

Гиалуроновая кислота (HA) — гликозаминогликан, присутствующий в фолликулярной жидкости, а также в жидкостях яйцеводов и матки.³⁴ Показано, что на поверхности эмбрионов имеются рецепторы к HA, которая участвует в регуляции экспрессии генов, пролиферации и дифференцировки клеток. Добавление HA в системы культивирования эмбрионов крупного рогатого скота улучшает развитие до стадии бластоцисты, повышает частоту выхода из прозрачной оболочки и устойчивость к криоконсервации.^35–38 Традиционным источником HA служат петушиные гребни, однако её также можно получать биосинтетическим путём при ферментации с участием Streptococcus equi без использования каких-либо продуктов животного происхождения.

Аминокислоты

Добавление всех 20 незаменимых и заменимых аминокислот в системы культивирования эмбрионов стало практически повсеместной практикой. Роль отдельных аминокислот, а также всех 20 аминокислот в совокупности в развитии эмбрионов и повышении их жизнеспособности рассмотрел Гарднер.³⁹ При отсутствии сыворотки в средах для культивирования добавление аминокислот отчасти заменяет её полезное действие.

Антиоксиданты

Антиоксиданты уменьшают образование в средах свободных радикалов, способных вызывать повреждения. В качестве антиоксидантов в средах для эмбрионов часто используют глутатион, BSA, аскорбиновую кислоту и каталазу.

Хелатирующие агенты

Хелатирующие агенты — это вещества, связывающие ионы тяжёлых металлов. В совершенно чистой среде они не требовались бы, однако всегда существует вероятность того, что следовые количества тяжёлых металлов попадут в состав среды с водой или солями реактивов. Трансферрин, BSA и этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) действуют как хелатирующие агенты.

Осмолиты

Осмолиты — это органические соединения, которые участвуют в поддержании объёма клеток и внутриклеточных органелл, а также водного баланса. Когда клетки набухают под действием внешнего осмотического давления, в мембране открываются каналы, через которые осмолиты выходят из клетки, увлекая за собой воду и восстанавливая нормальный объём клетки. Глицин — осмолит и самая маленькая из так называемых заменимых аминокислот, которые обычно добавляют в культуральные среды и в некоторые составы сред для временного хранения и криоконсервации. Физиологические основы осмолитных свойств глицина при культивировании эмбрионов подробно описали Steeves и соавт. .⁴⁰

pH и буферные системы

Внутриклеточный pH (pHi) эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro, составляет 7.2 при измерении с помощью pH-чувствительного зонда.⁴¹ Это исследование также показало, что культивируемые эмбрионы крупного рогатого скота после воздействия кислой среды восстанавливались гораздо легче, чем после воздействия щелочной. В действительности при воздействии на эмбрионы среды с pH выше 8 значение pHi снижалось лишь приблизительно до 7.8. В классическом исследовании Kane⁴² показал, что наибольшая доля бластоцист кролика выходила из прозрачной оболочки в ходе IVC при pH в диапазоне 7.2–7.4; при pH ниже 7.0 или выше 7.8 эта доля резко снижалась. pH большинства сред для IVP крупного рогатого скота находится в диапазоне 7.3–7.4, за исключением сред для оплодотворения, у которых он обычно составляет 7.5–7.6.

Фосфатно-солевой буфер (PBS), широко применяемый при извлечении эмбрионов, полученных in vivo, содержит фосфат в качестве буферного компонента. Хотя фосфат не является особенно эффективным буфером, добавление сыворотки или BSA повышает буферную ёмкость PBS. Среды для IVP, напротив, обычно находятся в инкубаторе с атмосферой, содержащей 5% CO2. Бикарбонат в составе этих сред обеспечивает стабильный pH благодаря равновесию, устанавливающемуся между бикарбонатом и CO2. Однако после извлечения сред на основе этой системы из инкубатора pH быстро снижается и за несколько минут на воздухе достигает неприемлемого уровня кислотности. Поэтому среды, используемые для промывания яйцеклеток и зигот между этапами IVP, а также для их хранения на воздухе перед переносом или криоконсервацией, содержат цвиттерионные буферы MOPES или HEPES.

Осмолярность

Оптимальная осмолярность для поддержания жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота при получении эмбрионов in vitro составляет приблизительно 275 mmol/L. Это справедливо и для других видов, таких как кролик, крыса и свинья.⁴³На практике кратковременное воздействие среды с осмолярностью от 250 до 300 mmol/L не оказывает неблагоприятного влияния на эмбрионы крупного рогатого скота и, вероятно, лошадей. Исследования показали, что общая осмолярность от 250 до 270 mmol/L, по-видимому, оптимальна, когда эмбрионы крупного рогатого скота, полученные in vitro, культивируют в среде KSOM.⁴⁴

При регулировании осмолярности сред важно учитывать, какие вещества добавляют или содержание каких веществ уменьшают, чтобы повысить или понизить осмолярность. Наиболее распространённая соль во всех средах, используемых при процедурах ЭКО, — NaCl, однако было показано, что при концентрациях выше 95 mmol/L она отрицательно влияет на развитие эмбрионов крупного рогатого скота.⁴⁴Таким образом, положительный эффект осмолярности ниже 300 mmol/L, наблюдавшийся в большинстве исследований, вероятно, обусловлен снижением концентрации Na⁺, а не снижением осмолярности как таковой (осмолярность жидкости яйцевода составляет >300 mmol/L).

Созревание

Успех получения эмбрионов in vitro во многом зависит от качества исходного материала — ооцита. Микрофотографии свежеполученных ооцитов четырёх основных категорий представлены на рисунке 81.2. Потенциал ооцитов этих категорий к созреванию и развитию в эмбрионы существенно различается: от типа 1 с наибольшим потенциалом до типа 4, потенциал которого практически равен нулю.¹⁶В таблице 81.2 показана способность этих ооцитов к оплодотворению, развитию до стадии бластоцисты и наступлению беременности.

Ооцит, пригодный для получения эмбрионов in vitro, называют «созревшим». Созревание включает ряд процессов, которые начинаются во внутриутробном периоде с вступления в мейоз. К моменту рождения мейоз в ооцитах останавливается на стадии диплотены, хотя они продолжают расти. Мейотическая активность возобновляется лишь после полового созревания, когда ооциты подвергаются воздействию предовуляторных пиков гонадотропинов — лютеинизирующего гормона (LH) и FSH. Эти гормоны вызывают изменения экспрессии генов, а также морфологических и физиологических характеристик текальных клеток, клеток гранулёзы, кумулюса и ооцита в составе фолликула яичника. В каждом эстральном цикле часть ооцитов вовлекается в продолжение мейоза, который вновь останавливается на стадии метафазы II; на этой стадии происходит их овуляция. Изменения, происходящие между остановкой мейоза на стадиях диплотены и метафазы II, считаются созреванием.⁴⁵

Созревание незрелых ооцитов in vitro (IVM) происходит по иному механизму, чем созревание ооцитов in vivo. Извлечение ооцита из фолликулярной среды, сдерживающей его созревание, и последующее помещение в благоприятные условия культивирования приводят к спонтанному созреванию без той последовательности физиологических процессов, которая происходит in vivo , хотя могут наблюдаться некоторые морфологические изменения (например, разрастание клеток кумулюсаg).⁴⁶ Условия in vitro моделируют некоторые физиологические изменения благодаря добавлению гормонов, в том числе LH, FSH и эстрадиола-17β, характерных для преовуляторного фолликула, а также гормонов роста или эпидермального фактора роста.⁴⁷

Способ получения ооцитов и степень их зрелости определяют, как с ними следует обращаться после получения. Незрелые ооциты можно получать от коров, не подвергавшихся стимуляции,

I II
III IV

Рисунок 81.2 Типы ооцитов крупного рогатого скота, полученных из яичников до созревания in vitro (IVM). Краткое описание: I — более четырёх слоёв клеток кумулюса; II — от одного до трёх слоёв клеток кумулюса; III — ооцит без клеток кумулюса; IV — разросшийся кумулюс. Воспроизведено с разрешения Hasler.¹¹

Таблица 81.2 Потенциал оплодотворения и эмбрионального развития у различных типов незрелых ооцитов крупного рогатого скота.¹¹

Значения в пределах одного столбца, отмеченные разными надстрочными буквами (a, b или c), значимо различаются ( P < 0.025). Источник : воспроизведено с разрешения из: Hasler J. Перенос эмбрионов и оплодотворение in vitro. В кн.: Schatten H, Constantinescu GM (ред.) Сравнительная биология размножения . Эймс, Айова: Blackwell Publishing, 2007, с. 171–211.

у которых проводят трансвагинальную аспирацию ооцитов (OPU) каждые 3–7 дней независимо от стадии полового цикла; однако можно также приурочить аспирацию к периоду после стимуляции яичников и введения LH или гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH), чтобы получить зрелые ооциты. Такие В естественных условиях созревшие ооциты не требуют дальнейшего созревания in vitro , хотя несколько часов в среде для созревания перед оплодотворением могут быть полезны. Ооциты, аспирированные из яичников коров, забитых на бойнях, получают преимущественно из фолликулов диаметром 3–8 mm; полученные группы ооцитов различаются по степени зрелости. Тем не менее большинство этих ооцитов способны созреть за 24-часовой период IVM.

Оплодотворение

После завершения IVM ооциты готовы к оплодотворению. Для этого ооциты совместно инкубируют со сперматозоидами, обычно в планшете с 4 лунками, хотя это можно делать и

в микрокапле под слоем масла. В большинстве лабораторий совместная инкубация длится 18 часов, хотя большинство случаев оплодотворения происходит в течение первых 12 часов.

При эякуляции сперматозоиды подвижны, но ещё не способны оплодотворить ооцит. Совокупность изменений, через которые должен пройти сперматозоид, прежде чем он сможет оплодотворить ооцит, называется капацитацией. Хотя этот процесс был открыт в 1951 году Чангом⁴⁸ и Остином,⁴⁹ молекулярные механизмы капацитации остаются неясными. Обычно капацитация происходит в перешейке яйцевода, хотя у некоторых видов она может начинаться в шейке матки, где цервикальная слизь способствует удалению белков с поверхности сперматозоидов. Задача специалистов, проводящих IVF, — воспроизвести эти условия, создав для сперматозоидов среду, способствующую капацитации. Температура имеет решающее значение для успешной капацитации. Данные, полученные на овцах и свиньях, указывают на то, что капацитация наиболее эффективна при температуре тела, а не при 37 °C, на которую настроены многие инкубаторы (обзор см. в источнике 50). Это может